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第一部分外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的分选及鉴定【目的】分选出纯度较高的人外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞,为后续细胞实验的准确性提供保。【方法】取健康志愿者外周血20ml,抗凝后置于冰上保存备用,用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出外周血中的单个核细胞,将所得的单个核细胞经抗体孵育后,通过免疫磁珠分选法分选出CD4+CD25+CD127-调节性T细胞,所得细胞经过流式抗体染色孵育后上流式细胞仪检测纯度。【结果】通过免疫磁珠法分选得到的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞纯度都在90%以上【结论】免疫磁珠分选外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞,所得细胞纯度较高,可以满足后续实验。第二部分力生长因子对人外周血调节性T细胞体外增殖的影响【目的】探讨力生长因子(Mechano growth factor,MGF)对人外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)体外增殖的影响。【方法】:(1)用免疫磁珠法分选20毫升人外周血得到的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞,用羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE)标记细胞后,通过CD3,CD28,IL-2刺激,以不同浓度MGF(0n M,10n M,100n M)干预细胞6d后,经流式抗体染色孵育后,上机检测细胞增殖情况。(2)分离4毫升外周血中单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),通过CD3,CD28,IL-2刺激,以不同浓度MGF(0n M,10n M,100n M)干预1d后,经流式抗体染色孵育,上机检测TREG细胞占PBMC的比例。【结果】:(1)在分离纯化的TREG细胞,MGF干预6d后二代细胞占总细胞比例,0n M MGF组为:49.66%±9.86%,10n M MGF组为:58.66%±5.95%,100n M MGF组为:62.6%±4.66%。100n M MGF组的增殖效率高于0n M MGF组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)MGF干预1d后,PBMC中TREG细胞比例,0n M MGF组为:17.82%±1.23%,10n M MGF组为:20.73%±1.61%,100n M MGF组为:20.29%±1.46%,10n M MGF组和100n M MGF组比例都高于0n M MGF组(P<0.05)。【结论】:力生长因子MGF对人外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞体外增殖具有促进作用。第三部分力生长因子对人外周血单个核细胞中Th17(T helper cell 17)/Treg比例的影响【目的】探讨力生长因子干预外周血单个核细胞后,外周血单个核细胞中Th17/Treg细胞比例的改变【方法】抽取健康人4毫升外周血,用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出单个核细胞,经CD3,CD28,IL-2(interleukin-2)刺激后,以不同浓度MGF(0,10,100n M)干预1d后,经流式抗体染色孵育,上流式细胞仪检测不同药物浓度Th17与Treg在PBMC中的比例,并计算出不同药物浓度下Th17/Treg比值。【结果】不同浓度力生长因子干预PBMC 1d后,各组Treg细胞占PBMC比例为,0n M MGF组为:21.80%±1.02%,10n M MGF组为:23.55%±1.16%,100n M MGF组为:23.28%±0.70%;各组TH17细胞占PBMC比例为,0n M MGF组为:10.04%±2.08%,10n M MGF组为:9.29%±1.85%,100n M MGF组为:6.48%±1.26%;各组Th17/Treg比例为,0n M组比值为:0.46±0.10,10n M组比值为0.40±0.09,100n M组比值为0.29±0.06,100n M组Th17/Treg比例与0n M组相比,明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)【结论】力生长因子MGF干预外周血PBMC后,外周血PBMC中Treg比例增高,Th17比例降低,Th17/Treg比值下降。