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在利用sn-1,3位置选择性的脂肪酶催化植物油脂转变为质构脂质的同时,还可以获得绿色新型生物能源——生物柴油。开发此工艺路线,对于植物油脂深加工和提高产品附加值具有重要意义,但目前我国关于sn-1,3位置选择性脂肪酶和质构脂质的研究开发尚处于起步阶段。本实验重点立足于研究开发具有sn-1,3位置选择性的脂肪酶,以期为发展质构脂质奠定酶学基础。本论文的主要内容和结果如下:筛选到一株热稳定、耐酸和高比活力脂肪酶产生菌株。以罗丹明B作为指示剂,利用选择性培养基,从油污土壤中筛选到一株胞外脂肪酶高产菌株,经形态学和ITS序列鉴定为黑曲霉,该菌株编号为F044。黑曲霉F044脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为73.71倍,活性回收率为33.99%。对纯化脂肪酶酶学性质的研究表明:该脂肪酶分子量为35～40 kDa,水解橄榄油的最适温度和最适pH分别为45℃和7.0,在60℃以下和pH2.0～9.0之间有很好的稳定性。该脂肪酶的水解活性对Ca2+表现出明显的依赖性,而Mn2+、Fe2+和Zn2+对水解活性则有显著的抑制作用。在最适条件下水解pNPP的Km和Vmax分别为7.37 mmol/l和25.91μmol/min.mg。其N-端的15个氨基酸残基序列为Ser(Glu/His)-Val-Ser-Thr-Ser-Thr- Leu-Asp-Glu-Leu-Gln-Leu-Phe-Ala-Gln。首次克隆了黑曲霉脂肪酶基因。根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸残基序列,结合丝状真菌脂肪酶分子活性中心和第一个氧阴离子洞区的保守氨基酸残基序列,运用生物信息学方法,从NCBI核酸数据库中找到一个与黑曲霉脂肪酶基因同源的侯选基因A84689。根据该基因序列,设计引物直接PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl。anl全长1044 bp,含3个内含子,分别为54 bp,45 bp和51 bp,编码297个氨基酸(含信号肽27个氨基酸)。在基因水平上,anl与其它脂肪酶基因核苷酸序列没有任何同源性;在蛋白质水平上,anl编码的氨基酸序列与A. flavus, T. lanuginosus, P. allii脂肪酶氨基酸序列分别有40%、50%和40%的同源性。首次实现了黑曲霉脂肪酶基因的异源表达。将黑曲霉FO44脂肪酶基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上,转化E. coli BL21(De3)。经IPTG诱导后,成熟黑曲霉F044脂肪酶的编码基因在宿主菌中大量表达,表达量为50 mg/g湿细胞,但均以无活性的包含体形式存在。利用Ni-NTA金属亲和色谱柱,一步纯化出N-端携带6×His标签的重组脂肪酶蛋白。通过大量稀释法和DEAE Sepharose Fast Flow柱层析法相结合的复性方法,变性后的纯化重组脂肪酶蛋白在体外实现再折叠复性。复活后的重组脂肪酶比活力为221.49 U/mg。将N-端融合有6×His编码序列的成熟黑曲霉F044脂肪酶基因克隆到pPIC9K载体上,转化P. pastoris GS115。经甲醇诱导表达后,黑曲霉F044脂肪酶基因在P. pastoris GS115中实现了功能性表达,发酵上清液脂肪酶酶活为15.50 U/ml。利用Ni-NTA金属亲和色谱柱,一步纯化出N-端携带6×His标签的重组脂肪酶蛋白。SDS-PAGE电泳显示,P. pastoris GS115产生两种分子大小不同的重组脂肪酶蛋白。Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化出这两种重组脂肪酶蛋白,均有脂肪酶活性,其中分子量较小的重组脂肪酶蛋白水解橄榄油的比活力为812 U/mg。首次尝试利用BioEdit、PSIPRED和SwissModel等软件或服务器对黑曲霉脂肪酶的一级结构、二级结构和三级结构进行了分析。分析结果显示,无论是在一级结构、二级结构还是三级结构上,预测的黑曲霉脂肪酶结构与丝氨酸水解酶结构均相吻合。预测的黑曲霉脂肪酶三级结构与黑曲霉阿魏酸酯酶三级结构在“盖子”结构区存在显著差异。