背景和目的随着现代医学影像诊断和介入治疗的快速发展，造影剂肾病(CIN)的发病率呈上升趋势，其发病机制、干预措施也受到更多的重视。老年糖尿病人群中CIN的发病机制尚未完全明确，氧化应激以及信号传导是目前研究的热点。我们通过制作老年糖尿病大鼠模型，观察造影剂对肾功能和肾组织一氧化氮(NO)、一氧化氮合成酶(NOS)及谷胱甘肽(GSH)的影响，探讨了NO、NOS及GSH在CIN发病机制中的作用。继而构建表达了两种NOS的嵌合体酶，研究了嵌合体酶的类型和结构对NO合成活性的影响。临床工作中对于老年患者，通过肌酐或者由肌酐计算得出的肾小球滤过率可能无法准确反映肾功能的变化，从而延误CIN的诊断。本论文通过对白细胞介素18和胱抑素C在老年糖尿病患者中的表达研究,寻找早期、敏感、特异预测CIN的生物学指标。考虑到氧化应激在CIN发病机理中的作用，抗氧化剂对于高危人群预防CIN的发生可能有一定的效果。GSH作为复杂的抗氧化网络的中心，其功能是通过缓冲活性氧、调节NO循环和改善控制着生长、发展和防御的细胞氧化还原信号传递系统来体现的。评价还原型谷胱甘肽联合生理盐水水化对老年糖尿病患者CIN干预效果。由于血液中的存在着大量GSH，本论文还研究了GSH与血红蛋白的结合过程的机理，进一步了解GSH发挥作用的机制。本论文的研究内容主要包括三个部分。第一部分：低渗造影剂对老年糖尿病大鼠肾毒性及一氧化氮合成酶对一氧化氮合成机理影响的研究一、材料与方法方法是通过建立老年糖尿病大鼠模型，观察尾静脉注射欧乃派克350(10ml/kg)后，大鼠血肌酐、尿素氮以及肾组织匀浆NO、NOS和GSH的含量。构建表达了两种NOS的一氧化氮合成酶，获取了一氧化氮合成酶的光谱，研究了一氧化氮合成酶的NO合成活性，测试了对铁氰化物、细胞色素C还原速率、黄素、NADPH氧化还原速率的影响。二、结果结果是老年糖尿病大鼠血肌酐、尿素氮与正常对照组比较均升高(P <0.05)，肾组织匀浆NO、NOS、GSH与正常对照组比较均下降。注射造影剂后，血肌酐与正常对照组比较明显升高(P <0.01)，肾组织匀浆NO和NOS与糖尿病对照组比较下降(P <0.05)。nNOSeFNR一氧化氮合成酶表现出较低的血红素还原速率。第二部分：白细胞介素18、胱抑素C对老年糖尿病患者造影剂肾病的预测作用研究一、材料与方法选择2011年1月到2011年10月在我院接受增强CT检查的年龄大于60岁、糖尿病史1年以上、无明显肾功能异常的患者共30例，患者均采用低渗非离子型造影剂。ELISA法测定造影前和造影后24小时、48小时IL-18以及血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、CysC。二、结果观察对象均无造影剂肾病的发生，造影后血IL-18与造影前比较无统计学意义(P>0.05)，造影后24小时尿IL-18、血胱抑素C升高明显，与造影前比较差异有统计学意义(P <0.05)，48小时后SCr升高明显(P <0.05)。第三部分：还原型谷胱甘肽对老年糖尿病患者造影剂肾病影响及与血红蛋白结合过程的研究一、材料与方法将准备采用低渗造影剂进行增强CT扫描的96位糖尿病患者(年龄≥60岁)随机分为两组。一组静脉注射还原型谷胱甘肽(于扫描前静脉注射溶于100ml生理盐水中的1800mg还原型谷胱甘肽，扫描后同等剂量注射两天)，同时以1ml/kg BW/h的速度静脉注射生理盐水(GSH组，n=48)；另一组仅以相同速度静脉注射生理盐水(对照组，n=48)。SCr、BUN、CysC和尿IL-18分别于造影前和造影后48小时测量。肌酐高于基线0.5mg/dL或者比肌酐基线值增长25%即被确认为CIN。利用多种光谱法研究了还原型谷胱甘肽与Hb的结合过程，确证了GSH对血红蛋白的猝灭机制。根据所得到的结合常数等参数推断出GSH与血红蛋白之间的相互作用力的类型。由F ster能量转移理论可以得到GSH与血红蛋白的结合距离。利用多种分子光谱法研究了GSH的存在对血红蛋白构象的影响。二、结果GSH组和对照组在基线特征和基线肾功能方面没有显著性差异。GSH组CIN的发病率稍低于对照组(2.08%vs.8.33%, P=0.364)。增强CT扫描后两组的SCr、BUN、CysC、尿IL-18均升高，估测肾小球滤过率(eGFR)均降低。造影后两组SCr(P=0.001)，eGFR(P=0.002), BUN(P <0.001)，CysC(P=0.001)和尿IL-18(P <0.001)有显著性差异。GSH浓度的增加导致Hb的荧光强度逐渐降低。依据热力学原理求得一系列热力学参数，从表中看出, ΔH <O、ΔS <0、ΔG <O,说明GSH与Hb作用过程是一个焓变减小、熵减、吉布斯自由能降低的自发过程，可推断出GSH与Hb之间的作用力是以氢键及范德华力结合。依据峰位置的红移或蓝移来说明氨基酸周围微环境的变化，最大发射波长发生了明显的红移现象，表明GSH改变了Hb中色氨酸残基所处的微环境，极性增强。结论1.低渗造影剂可以引起老年糖尿病大鼠肾损伤，NOS、NO的代谢以及信号传递可能与其有关。2.一氧化氮合成酶的种类和结构性质对一氧化氮的合成过程有显著影响。3.尿IL-18和Cys C是可以早期反映肾损伤的敏感指标，对CIN的早期诊断及防治有重要作用。4.还原型谷胱甘肽加生理盐水水化可能通过调节氧化和抗氧化系统预防造影剂肾病的发生。5.确定了还原型谷胱甘肽与Hb的结合过程及相互作用类型。