【摘 要】
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【研究背景】登革病毒（dengue virus,DENV）属于黄病毒属,是一种蚊媒传播病毒,近年来引发了严重的公共卫生问题。然而目前尚无有效的抗DENV药物应用于临床治疗。因此,寻找有效的抗DENV药物具有重要的临床意义。登革病毒NS5蛋白主要由两个功能结构域组成,其中N端是甲基转移酶结构域（methyltransferase,MTase）主要负责催化病毒RNA帽子结构的N-7和2′-O甲基化;而
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【研究背景】登革病毒（dengue virus,DENV）属于黄病毒属,是一种蚊媒传播病毒,近年来引发了严重的公共卫生问题。然而目前尚无有效的抗DENV药物应用于临床治疗。因此,寻找有效的抗DENV药物具有重要的临床意义。登革病毒NS5蛋白主要由两个功能结构域组成,其中N端是甲基转移酶结构域（methyltransferase,MTase）主要负责催化病毒RNA帽子结构的N-7和2′-O甲基化;而C端为依赖RNA的RNA聚合酶结构域（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）在病毒复制过程中主要负责子代RNA的合成。NS5-RdRp作为病毒复合酶在病毒生命周期中扮演着重要的角色,在复制过程中同时负责负链和正链RNA的合成;NS5和NS3蛋白是病毒复制复合体的核心,两者相互作用共同承载大部分病毒RNA复制所需的催化活性。上述蛋白高度保守使其成为抗DENV药物研发的理想靶标。【研究目的】通过已建立的药物体外细胞筛选模型筛选出抗DENV化合物并构建靶向NS5-RdRp的药物筛选平台,对具有抗DENV活性的化合物进行机制研究,为抗DENV药物的研发提供科研依据。【研究方法】（1）抗DENV活性检测:噬斑法和MTT法对化合物进行初步筛选;RT-PCR法检测不同浓度的化合物对病毒RNA合成的抑制效果;Western blot实验和免疫荧光实验检测化合物对DENV E蛋白表达的影响。（2）抗DENV化合物机制研究:靶向NS5-RdRp药物筛选平台筛选出有效化合物;分时给药实验探寻化合物作用于DENV生命周期的大致阶段;计算机辅助的分子对接实验检测化合物与目的蛋白的结合能力;通过表面等离子共振（SPR）检测原核表达的RdRp与化合物的结合作用;细胞热位移实验（CETSA）验证化合物与DENV蛋白的相互作用【实验结果】吲哚类衍生物13和15具有较好的抗DENV活性和较低的细胞毒性,半数有效浓度(EC50)分别为9.35±3.03μM和4.79±0.82μM,半数细胞毒浓度(CC50)均大于200μM;化合物13和15剂量依赖性抑制DENV RNA及蛋白的合成;化合物13和15能够抑制DENV NS5-RdRp的活性;两者均在病毒进入细胞后阶段发挥抗病毒作用;分子对接结果发现化合物13和15与DENV NS5的RdRp结构域通过氢键和疏水相互作用,建立了拟合的低能构象;SPR成像结果也支持化合物13和15与NS5-RdRp有很强的相互作用。嘧啶酮类衍生物WYM-19和rrm-19具有较好的抗DENV活性和较低的细胞毒性,EC50分别为5.48±0.42μM和7.61±0.26μM,半数细胞毒浓度(CC50)均大于200μM;化合物WYM-19和rrm-19剂量依赖性抑制DENV RNA及蛋白的合成;分子对接结果发现WYM-19和rrm-19与DENV NS5有较强的结合能力,结合能为-9.1 kcal/mol;两者均在病毒进入细胞后发挥抗病毒作用;CETSA实验表明WYM-19和rrm-19均能与DENV NS5蛋白结合;但化合物WYM-19和rrm-19不能抑制DENV NS5-RdRp的活性且不与NS5-Mtase结合。【实验结论】本研究筛选发现吲哚类衍生物13、15和嘧啶酮类衍生物WYM-19、rrm-19具有良好的抗DENV活性:吲哚类衍生物13和15通过靶向DENV NS5-RdRp抑制病毒RNA的合成从而发挥抗病毒活性;嘧啶酮类衍生物WYM-19和rrm-19可能通过与NS5蛋白相互作用发挥抗病毒作用,以上都是具有良好发展前景的抗DENV先导化合物。
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