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目的:紫杉醇(Taxol)是对多种类型肿瘤细胞具有细胞毒作用的四环二萜类化合物,在临床上已作为一线或后续药物治疗乳腺癌、转移性卵巢癌及卵巢来源的输卵管及腹膜肿瘤。近年来,紫杉醇被证实在头颈部鳞癌治疗中亦具有较好的效果,并已被应用于多个临床试验。但紫杉醇在头颈部鳞癌治疗中也同样存在的多药耐药降低了紫杉醇的抗癌效果,目前相关的研究较少。本研究以喉癌Hep-2细胞为亲本细胞,用紫杉醇诱导筛选耐药细胞株Hep-2T,研究耐药细胞株的多药耐药特性,比较和分析两者之间的差异,为逆转喉癌的多药耐药提供理论依据。方法:用紫杉醇以浓度梯度递增法诱导筛选喉癌Hep-2细胞的多药耐药细胞株Hep-2T;比较两种细胞形态学和倍增时间的差异。以ATP酶检测法分别检测两种细胞对紫杉醇、多柔比星、吉西它宾、5-FU及顺铂的IC50,从而确定、比较Hep-2T细胞和Hep-2细胞的耐药倍数。流式细胞术检测两种细胞的细胞周期分布情况、细胞凋亡以及罗丹明聚集情况。另以Hoechst染色法验证两种细胞之间凋亡的差异。以Realtime Quantitative RT-PCR法检测MDR1和MRP1基因,Western-blotting法检测MDR1和MRP1蛋白表达情况。结果:Hep-2T细胞对紫杉醇、多柔比星、吉西它宾、5-FU及顺铂的药物耐受分别是Hep-2细胞的104、46.78、1.95、2.50、1.05倍。与Hep-2细胞比,Hep-2T细胞G0/G1期细胞百分比明显增多(P<0.05),而G2/M和S期细胞百分比则明显减少(both, P<0.05)。当以紫杉醇对Hep-2细胞的IC50浓度干预时,流式细胞术和Hoechst染色均显示Hep-2细胞的凋亡细胞比例较Hep-2T的明显增高(45.32±6.47% vs. 4.26±1.72%, P<0.01, flow cytometry),(54.47+8.95% vs. 9.84+2.53%, P<0.01, Hoechst staining)。流式细胞术罗丹明聚集分析结果显示,Hep-2细胞罗丹明阳性百分比较Hep-2T明显增高(99.32+0.18% vs. 9.45+6.98%, P<0.01)。Hep-2T细胞MDR1表达在基因和蛋白水平明显高于Hep-2细胞(P<0.05, P<0.01)。MRP1在基因和蛋白水平的表达亦高于后者(both, P<0.05),但增高程度不如MDR1明显。结论:在探求逆转紫杉醇所致喉癌多药耐药的方法及途径时,应着重于MDR1/P-gp;当联合应用化疗药物时,应考虑非P-gp作用底物的药物及细胞周期特异性药物,以防MDR出现所致的化疗不敏感。第二部分目的:肿瘤多药耐药(Multidrug resistance, MDR)和侵袭转移是恶性肿瘤病人治疗失败和死亡的主要原因。目前已有众多针对MDR和侵袭转移的研究。但大多是分别对MDR和侵袭转移进行研究,肿瘤MDR形成以后可以引起肿瘤的化疗不敏感,但是否导致肿瘤的侵袭性和转移性改变,MDR与侵袭转移是否密切相关,目前相关的研究较少,仅有部分研究提示两种现象之间可能存在着某种联系,但具体机制尚不清楚。人喉癌尤其是晚期喉癌总体而言对化疗不敏感,其原因主要是对化疗药物耐药,既有原发的耐药,也有在用药过程中所致的继发耐药。同时喉癌也是出现侵袭较多的一种肿瘤。因而针对喉癌研究MDR和侵袭之间的关系将有重要的意义。VEGF作为内皮细胞迁移和增殖的最强有力的刺激因素和血管渗透的诱导者,对肿瘤增殖、浸润和转移起着非常重要的作用。VEGF及其受体VEGFR-2可能对肿瘤的MDR存在调节作用,但目前相关的报道也较少。本研究以紫杉醇诱导筛选的人喉癌Hep-2多药耐药细胞株(Hep-2T)为研究对象,研究MDR1/P-gp及VEGFR-2与肿瘤多药耐药细胞侵袭之间的关系及其机制。方法:以Transwell检测细胞侵袭能力,分析比较MDR细胞和非MDR细胞、加用和不加用VEGF后细胞侵袭能力的变化;以Realtime Quantitative RT-PCR和Western-blotting分别检测Hep-2、Hep-2T细胞VEGFR-2 mRAN和蛋白表达量;用RNAi抑制Hep-2T细胞MDR1并以Realtime Quantitative RT-PCR和Western-blotting分别验证RNAi抑制MDR1的效果;进而用Transwell验证MDR1/P-gp改变对肿瘤侵袭能力的影响。以SU1498阻断VEGFR-2受体后用Transwell验证其对肿瘤侵袭能力的影响。结果:Hep-2T细胞的侵袭能力较Hep-2细胞明显增强(P<0.01)。加用VEGF的Hep-2细胞侵袭能力(0.139+0.041)较不加用VEGF的Hep-2细胞(0.077+0.021)增强(P<0.01);VEGF对Hep-2T细胞侵袭能力也具有相同的影响趋势(P<0.01)。2×2析因实验设计方差分析显示MDR和VEGF之间存在交互影响(P<0.05),MDR和VEGF之间具有协同作用,使细胞的侵袭能力明显提高。Realtime Quantitative RT-PCR检测显示Hep-2T细胞VEGFR-2表达较Hep-2细胞增高1.73+0.24倍(P<0.05);Western-blotting检测Hep-2T细胞VEGFR-2表达量较Hep-2细胞增高1.17倍(P<0.05)。SU1498阻断VEGFR-2受体后,Hep-2T细胞侵袭能力有明显的下降(0.137+0.021 vs. 0.208+0.018, P<0.01)。经RNAi抑制Hep-2T细胞MDR1后MDR1 mRNA下降了73.5%(P<0.05),MDR1/P-gp蛋白表达亦明显下降(P<0.01)。RNAi抑制Hep-2T细胞MDR1同时应用SU1498,细胞的侵袭能力较单用SU1498降低(P<0.05);较单用RNAi也有明显降低(P<0.01);相比两者都不用的Hep-2T细胞而言也有明显降低(P<0.01);2×2析因实验设计方差分析显示RNAi抑制Hep-2T细胞MDR1和SU1498具有协同降低Hep-2T细胞侵袭能力的作用(P<0.05)。结论:紫杉醇诱导筛选的喉癌MDR细胞的侵袭能力较非MDR细胞明显增强,这种增强与MDR1/P-gp和VEGFR-2表达增高有关;VEGF可以通过VEGFR-2促进细胞的侵袭能力;MDR1/P-gp和VEGF之间能够协同促进多药耐药细胞的侵袭能力,这种协同作用由多药耐药细胞VEGFR-2表达增高介导。