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研究目的前列腺素是启动人类分娩的最后通路,因此明确前列腺素的合成调控对解析分娩动因至关重要。人羊膜成纤维细胞是前列腺素的重要来源,我们前期研究发现糖皮质激素可以通过前列腺素E2(PGE2)激活cAMP/PKA/CREB信号通路从而促进人羊膜成纤维细胞环氧合酶-2(COX-2)表达和前列腺素合成,但介导cAMP/PKA信号通路激活的PGE2受体亚型及PKA磷酸化细胞核内CREB的途径尚不清楚。本研究旨在明确PGE2受体(EP)及PKA锚定蛋白(AKAP)在cAMP/PKA/CREB通路激活及COX-2表达诱导中的作用,为解析人类分娩启动机制和临床干预分娩时机提供新思路。研究方法将原代培养人羊膜成纤维细胞作为细胞模型,采用RNA测序、过表达质粒和小干扰RNA转染、受体激动剂和抑制剂、实时荧光定量PCR、蛋白印迹杂交、细胞免疫荧光染色和ELISA等实验技术探讨PGE2受体(EP2、EP4)及PKA锚定蛋白(AKAP79、AKAP95)在cAMP/PKA/CREB信号通路激活及COX-2表达诱导中的作用,并研究EP2、EP4及AKAP79、AKAP95的表达调控;同时收集足月择期剖宫产(无产程)及阴道分娩(有产程)产妇的羊膜组织,比较EP2、EP4及AKAP79、AKAP95在两组中表达量的差异。研究结果(一)PGE2受体EP2和EP4在cAMP/PKA通路激活和COX-2诱导中的不同作用1.PGE2受体包括EP1、EP2、EP3和EP4四种亚型,RNA测序和免疫染色结果表明,人羊膜成纤维细胞中主要表达EP2和EP4,EP1和EP3的表达则基本检测不到;2.在人羊膜成纤维细胞中,EP2受体激活后对PI3K无激活作用,但可以长时程促进PKA下游调控COX-2表达的两个关键转录因子CREB及STAT3磷酸化,并诱导COX-2表达。EP4受体激活后可以激活PI3K,并只能短暂促进CREB磷酸化和诱导COX-2表达,而对STAT3磷酸化无作用;3.PI3K抑制剂不仅可以增强PGE2和EP2激动剂对PKA的激活作用,促进CREB及STAT3的磷酸化作用,而且还可以增强PGE2和EP2激动剂对COX-2的诱导作用;4.EP2受体拮抗剂可以阻断PGE2对CREB和STAT3的磷酸化及COX-2的诱导。过表达EP4受体可以削弱PGE2对COX-2的诱导作用,而EP4受体拮抗剂不仅增强PGE2对CREB及STAT3的磷酸化作用,还增强PGE2对COX-2的诱导作用;5.羊膜成纤维细胞COX-2表达的重要诱导因子糖皮质激素及PGE2诱导EP2受体表达,而抑制EP4受体表达;6.进入产程的羊膜组织EP2受体的蛋白水平升高,而EP4受体的蛋白水平下降。(二)AKAP79和AKAP95在cAMP/PKA/CREB通路激活和COX-2诱导中的作用1.人羊膜成纤维细胞各细胞组分蛋白分析及细胞免疫荧光显示,AKAP95位于细胞核内,而AKAP79位于细胞膜上。调控COX-2表达的两个关键转录因子CERB位于细胞核内,而STAT3位于细胞质内;2.敲低AKAP95的表达后,细胞核内PKA的调节亚基和催化亚基均减少,敲低AKAP95可以阻断CREB的磷酸化,但不影响STAT3磷酸化;3.敲低AKAP95的表达可以抑制COX-2的表达,而敲低AKAP79则不影响COX-2的表达;4.羊膜成纤维细胞COX-2表达的重要诱导因子糖皮质激素促进羊膜成纤维细胞AKAP95的表达;5.进入产程的羊膜组织AKAP95、COX-2和磷酸化CREB的量显著升高。结论在人羊膜成纤维细胞中,EP2是介导PGE2激活cAMP/PKA/CREB信号通路的主要受体,EP4受体对PI3K的激活不利于EP2功能的发挥。羊膜成纤维细胞COX-2表达的重要诱导激素糖皮质激素及PGE2通过诱导EP2受体表达,抑制EP4受体表达,强化cAMP/PKA信号通路的激活及COX-2表达。AKAP95可以将PKA锚定在细胞核内,从而磷酸化位于细胞核内的CREB,参与COX-2的表达调控。糖皮质激素通过诱导AKAP95表达,使更多的PKA聚集到细胞核内,从而有利于CREB磷酸化,进一步促进COX-2表达及PGE2合成。