肺癌是分化程度低、临床治疗较差的一类肿瘤,其发病率和致死率均位居所有恶性肿瘤中的前列,目前临床的一线化疗药物虽然能抑制肺癌的发生发展,但存在严重的毒副反应。中医药能降低癌症的发病率、改善患者的生存质量,在肿瘤的治疗中具有很大的应用前景。基于活血化瘀、补气扶正的治疗原则,课题组前期对《金匮要略》中泽漆汤进行拆减和抗肿瘤活性检测,发现活血益气方（人参、丹参、甘草）具有抗肿瘤作用,且该作用可能与抑制PD-L1的表达有关。本课题将通过超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF-MS）法对活血益气方体内外的化学成分进行分析。并对血浆内的主要成分甘草次酸进行体外实验验证抗肿瘤效果并探索其作用机制。目的:本研究拟采用UPLC-Q/TOF-MS分析活血益气方体内外的化学成分。证实活血益气方体内主要成分甘草次酸的抗肿瘤作用并探讨其抗肿瘤作用可能通过抑制IL-1β/NF-κB的活性来下调PD-L1蛋白表达水平。方法:1.基于UPLC-Q/TOF-MS技术的活血益气方体内外化学成分研究对活血益气方进行数据采集,并利用TCMSP、Pubchem、Chemspider等数据库检索、自建人参、丹参、甘草化学成分数据库,结合一级MS信息和二级MS的碎片信息,比对其结构与二级碎片,利用特征碎片和中性离子损失的信息,判断断裂的基团是否为结构中的官能团,解析活血益气方水煎液中的化学成分。2.采用MetabolitePilotTM（v2.2）软件测定活血益气方入血原型成分和可能的代谢产物。3.MTT法检测甘草次酸对多种肺癌细胞和肺正常上皮细胞活性的影响,克隆形成实验检测甘草次酸对肺癌细胞和肺正常细胞增殖的影响。4.细胞划痕实验观察甘草次酸对肺癌H1975细胞迁移能力的影响,Transwell实验检测甘草次酸对肺癌H1975细胞迁移、侵袭能力的影响。5.qRT-PCR检测甘草次酸对肺癌 H1975 细胞 IL-1β、TNF-α、VEGF、IL-8、NF-κB、PD-L1等基因的表达。6.Western Blot检测甘草次酸对肺癌H1975细胞PD-L1蛋白表达的影响,细胞免疫荧光检测甘草次酸对肺癌H1975细胞NF-κB p65入核的影响。ELISA检测甘草次酸对肺癌H1975细胞IL-1β分泌的影响。结果:1.UPLC-Q/TOF-MS数据与自建数据库和文献对比,从活血益气方中初步鉴定得到了 87个化合物,27个来源于甘草,41个来源于丹参,19个来源于人参。其中包括甘草黄酮、人参皂苷、丹参酚酸、丹参醌类等。2.MetabolitePilotTM（v2.2）在小鼠血浆中测定得到活血益气方中6个原型成分和11种代谢物。3.HPLC和UPLC-Q/TOF-MS实验发现活血益气方水煎液中存在甘草主要的活性成分甘草酸,且在血浆中发现甘草酸的体内代谢产物甘草次酸。4.MTT实验结果显示甘草次酸对肺癌细胞A549、H1299、H1975、H460、95D均表现出随浓度和时间增加而上升的抑制率,克隆形成实验显示甘草次酸对肺癌细胞A549、H1299、H1975、H460、95D的增殖能力有显著的下降作用（P＜0.05或P＜0.01）。5.划痕实验和Transwell结果表明甘草次酸能显著抑制肺癌细胞H1975的迁移能力和侵袭能力（P＜0.05 或 P＜0.01）。6.qRT-PCR实验结果表明甘草次酸能显著下降肺癌细胞H1975细胞因子IL-1β、TNF-α、VEGF、IL-8的基因表达水平（P＜0.01或P＜0.001）。7.qRT-PCR和Western Blot实验结果表明甘草次酸能显著下降肺癌H1975细胞PD-L1的基因和蛋白表达水平（P＜0.01或P＜0.001）。8.免疫荧光检测结果显示甘草次酸能显著下降肺癌细胞H1975 PD-L1的基因和蛋白表达水平（P＜0.05 或 P＜0.01）。结论:活血益气方含有多种活性成分,初步鉴定得到了分别来源于人参、丹参、甘草的87种成分,主要是黄酮类、皂苷类、酚酸类等相应中药的代表性成分。在活血益气方水煎液中发现甘草的主要活性成分甘草酸,活血益气方处理后并在血浆样本中发现甘草酸主要代谢产物甘草次酸的存在。活血益气方处理后的小鼠血浆中代表性成分甘草次酸对多种肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力均有显著的抑制作用。甘草次酸可能是通过下调肺癌H1975细胞的炎症细胞因子表达,从而抑制NF-κB p65的核转位,最终抑制了 PD-L1的表达来发挥其抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的作用。