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研究背景:卵巢上皮性癌是死亡率最高的女性生殖系统肿瘤,主要是因其绝大多数患者发现时已出现肿瘤侵袭、转移。目前研究认为，耽瘤异质性是造成癌症转移、耐药和复发的主要原因。外泌体(exosome)是一种细胞分泌的纳米级生物囊泡,现有证据显示外泌体可以携带蛋白质、DNA、mRNA、miRNA和siRNA,起到细胞间通讯作用。肿瘤细胞来源的exosome因为负载了肿瘤抗原,可以刺激抗原呈递细胞而增强抗肿瘤细胞免疫、促进肿瘤的生长、增强免疫细胞对微生物感染的抵抗、参与调节肿瘤细胞和周围环境中的“卫星细胞”之间的通信。我们在前期研究中发现卵巢癌异质性细胞来源的外泌体也存在差异,证明外泌体同样存在异质性,这反映出其携带的母细胞生物学特点也具有差异。近年来,研究发现外泌体与肿瘤的转移密切相关,那么转移能力存在异质性的卵巢癌细胞所分泌的外泌体有可能携带了母细胞转移相关的信息。然而异质性的外泌体与卵巢癌的转移是否相关,其对卵巢癌的异质性是否有影响并不清。研究目的:1.探索研究迁移侵袭异质性的卵巢癌细胞其分泌的外泌体是否具有异质性;2.研究迁移侵袭异质性卵巢癌细胞分泌的外泌体对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响;3.探讨迁移侵袭异质性卵巢癌细胞分泌的外泌体影响卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的机制。研究方法:1.以卵巢癌细胞系SKOV3和A2780为实验用细胞,采用有限稀释法进行单细胞分选和克隆培养,通过Transwell实验筛选出高迁移侵袭性和低迁移侵袭性的SKOV3(分别命名为SK-H和SK-L)及A2780细胞(分别命名为A-H和A-L)克隆,并将不同迁移侵袭性的克隆进行培养扩增。2.通过超速离心法富集外泌体。使用透射电镜观察形态、Western blot检测标记蛋白、NTA检测粒径分布鉴定外泌体。3.Transwell实验、划痕实验以及动物体内实验检测经外泌体处理后卵巢癌细胞的迁移侵袭能力改变。4.通过高通量测序比较迁移侵袭异质性卵巢癌外泌体中miRNA的差异及卵巢癌细胞mRNA的差异,并应用Transwell实验、电镜检测自噬、免疫荧光、腺病毒转染、western blot、RNA结合蛋白免疫沉淀实验、pull down实验、qRT-PCR、流式分选、荧光原位杂交等技术探索迁移侵袭异质性外泌体影响卵巢癌细胞迁移侵袭性的分子机制。研究结果:1.SK-H和A-H细胞分泌的外泌体能够增强SK-L和A-L细胞的迁移和侵袭能力。2.SK-H和A-H细胞外泌体中hsa-miR-328-3p的显著上调,且与经过SK-Hexo和A-Hexo分别处理的SK-L和A-L mRNA联合分析发现hsa-miR-328-3p的直接靶基因Raf1参与mTOR和focal adhesion等信号通路中。3.过表达hsa-miR-328-3p能够增强SK-L和A-L细胞的迁移和侵袭性,且SK-L和A-L细胞中Raf1、mTOR的表达明显降低,ULK1和LC3B的表达升高,细胞自噬增强。4.过表达pri-miR-328-3p后,SK-L和A-L细胞分泌的外泌体中hsa-miR-328-3p表达也明显升高,且能够增强SK-L和A-L细胞的迁移和侵袭能力,细胞中Raf1、mTOR的表达明显降低,ULK1和LC3B的表达升高,细胞自噬增强。研究结论:1.迁移侵袭异质性的卵巢癌细胞其分泌的外泌体也具有异质性,且高迁移侵袭性卵巢癌细胞分泌的外泌体能够提高低迁移侵袭性卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。2.hsa-miR-328-3p能够靶向Raf1,通过抑制mTOR通路促进细胞自噬,进而提高卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。.3.外泌体能够携带hsa-miR-328-3p在异质性卵巢癌细胞间进行信息传递,并且通过靶向调控细胞自噬介导迁移侵袭异质性卵巢癌细胞间生物学特性的传导。