帕金森病是(Parkinson’ disease,PD)中枢神经系统常见的进行性、变性性疾病，黑质多巴胺能(Dopaminergic,DAG)神经元选择性的凋亡目前被认为是PD的主要病理变化，既往的重点主要集中在对DAG神经元凋亡机制的研究和治疗方面，而轴突变性被认为是神经元死亡后的伴随产物，因此一直未受到重视。但近年来的研究发现，单纯抑制神经元凋亡并不能有效延缓PD的发生和发展，而DAG轴突变性可能是PD发病的一个重要原因和靶点。尽管现在已经逐渐认识到PD中轴突变性的重要性，但是对于轴突变性在PD中的作用和机制，目前还缺乏了解，因此对轴突变性在PD中的作用和机制的研究不仅可以为PD发病机制的理解带来理论革新，还可为我们治疗PD提供新的策略和靶点，具有重大的理论和现实意义。第一部分：一个新的帕金森病多巴胺能神经元轴突变性体外实验细胞模型的建立目的：利用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP~+)对小鼠胚胎中脑多巴胺能神经元的毒性作用，建立一个新的PD多巴胺能神经元轴突变性体外实验细胞模型。方法：采用C57BL/6小鼠胚胎(孕14d)中脑腹侧组织进行原代细胞培养，实验分为对照组和不同浓度(0.1、0.5、1.0、10.0μM) MPP~+药物实验组，应用酪氨酸羟化酶(TH)免疫荧光化学细胞染色方法对DAG神经元损伤的形态学进行观察，对DAG神经元数量、轴突数目和长度分别在2、4、6、8、12、24h共6个时间点进行研究。TUNEL检测细胞凋亡情况。结果：MPP~+作用于DAG神经元后细胞数量减少，绝大多数表现为胞体存在，轴突的数目及长度明显减少，网状交织的轴突变得稀疏，表面不光滑，有的呈串珠样肿胀或轴突中断，少数表现为胞体空虚、丢失，仅有轴突存在。DAG神经元细胞数量、轴突长度、轴突数目的减少，对MPP~+有时间-剂量依赖性。分析数据发现只有10.0μM MPP~+作用DAG神经元24小时组在神经元数量、轴突长度、轴突数目这三个方面与其余各组之间比较有显著性差异(P<0.05)。此时，对照组DAG神经元的数量、轴突长度、轴突数目分别为(254±11)个/孔、(158.99±12.13)μm/个、(1.82±0.30)个，MPP~+实验组为(126±16)个/孔、(64.18±19.06) μm/个、(1.17±0.35)个。DAG神经元数量减少了50.39%，每个DAG神经元轴突长度减少了59.8%，每个DAG神经元的轴突数目减少35.7%。TUNEL检测10.0μM MPP~+作用DAG神经元24小时后DAG神经元以凋亡为主，占丢失细胞总数的90.7%。结论:0.1、0.5、1.0、10.0μM MPP~+均能引起DAG神经元损伤，形态改变、数量减少、轴突长度变短、数目减少。而以10.0μM MPP~+作用多巴胺能神经元24小时造模最为理想。第二部分:帕金森病多巴胺能神经元轴突变性指标的检测目的：观察淀粉样前体蛋白(APP)和微管蛋白β-TubulinⅢ在MPP~+作用DAG神经元后表达的变化情况，从轴浆运输障碍、微管出现解聚两方面来验证MPP~+诱导的DAG神经元轴突发生了变性。方法：分MPP~+实验组和对照组。细胞培养7天后，实验组应用10.0μM MPP~+作用24h，对照组不予任何干预。TH-APP免疫荧光双标来检测DAG神经元APP的表达。Weston-blot检测细胞β-TubulinⅢ的表达变化。MPP~+实验组使用含有洗脱剂的4%多聚甲醛固定，洗出游离的微管蛋白，检测细胞聚合状态的微管蛋白。对照组使用4%多聚甲醛固定，检测细胞总的微管蛋白。结果：对照组DAG神经元及轴突形态正常， APP呈低表达。MPP~+作用后DAG神经元轴突出现片段化，APP表达升高，在轴突中可见APP局部浓集。Weston-blot检测细胞β-TubulinⅢ的表达，对照组平均灰度值比值为10.08±0.6，实验组为4.36±0.3，与对照组相比实验组下降了56.75%。结论：10.0μM MPP~+作用DAG神经元24h，出现了轴浆运输障碍及轴突微管解聚现象，轴突发生了变性。第三部分:帕金森病多巴胺能神经元轴突变性相关信号通路的研究目的：探讨PI3-kinase/Akt/GSK-3β和Rho/ROCK信号通路可能参与了MPP~+诱导的DAG神经元轴突变性。方法：在已建立的细胞模型中使用GSK-3β抑制剂LiCl和ROCK抑制剂Fasudil。LiCl作用浓度为5、10、20、30μM，Fasudil作用浓度为25、50、100、150μM。研究分对照组和实验组。对照组细胞培养7天后，应用10.0μMMPP~+作用24h。实验组细胞培养7天后，应用10.0μM MPP~++不同浓度LiCl或10.0Μm MPP~++不同浓度Fasudil作用24h。TH免疫荧光染色观察轴突长度、轴突数目；实验组将有抑制作用浓度的LiCl、Fasudil组使用洗脱剂和对照组使用洗脱剂洗去游离的微管蛋白，用Weston-blot检测细胞聚合状态β-TubulinⅢ的表达。结果：①对照组轴突长度为(88.45±17.12)μm，实验组5、10、20、30μM LiCl作用后轴突长度分别为(119.03±25.19)、(115.92±20.10)、(97.21±15.58)、(88.31±16.26)μm。5、10μMLiCl组与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，20、30μM LiCl组与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。而5和10μM LiCl组、20和30μM LiCl组间无显著性差异(P＞0.05)。对照组轴突数目为(1.56±0.32)个，实验组5、10、20、30μM LiCl作用后轴突长度分别为(1.75±0.41)、(1.66±0.33)、(1.65±0.30)、(1.64±0.38)个，与对照组相比各浓度LiCl组无显著性差异(P＞0.05)。②对照组轴突长度为(86.34±16.18)μm，实验组25、50、100、150μM Fasudil作用后轴突长度分别为(95.97±20.67)、(118.30±19.11)、(132.39±26.95)、（87.01±25.89）μm。50、100μM Fasudil组与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，25、150μMFasudil组与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。而50和100μMFasudil组、25和150μMFasudil组间无显著性差异(P＞0.05)。对照组轴突数目为(1.55±0.29)个，实验组25、50、100、150μM Fasudil作用后轴突数目分别为(1.69±0.43)、(1.65±0.35)、(1.53±0.38)、(1.57±0.50)个，与对照组相比各浓度Fasudil组无显著性差异(P＞0.05)。Weston-blot检测细胞β-TubulinⅢ：③LiCl组实验结果显示：平均灰度值比值5μM LiCl组为5.68±0.29，10μM LiCl组为5.35±0.22，对照组为3.56±0.14，实验组与对照组有显著性差异(p＜0.05)，实验组之间无显著性差异（P＞0.05）。5、10μM LiCl作用后聚合状态β-TubulinⅢ的表达增高，其抑制了变性DAG轴突微管蛋白的解聚。④Fasudil组实验结果显示：平均灰度值比值50μM Fasudil组为4.61±0.32，100μMFasudil组为4.45±0.21，对照组为2.76±0.16，实验组与对照组有显著性差异(p＜0.05)，实验组之间无显著性差异(P＞0.05)。50、100μM Fasudil作用后聚合状态β-TubulinⅢ的表达增高，其抑制了变性DAG轴突微管蛋白的解聚。结论：PI3-kinase/Akt/GSK-3β和Rho/ROCK信号通路参与了MPP~+诱导的DAG神经元轴突变性。 LiCl、Fasudil在合适的浓度可以发挥信号通路抑制作用而保护了变性的DAG神经元轴突。