第一部分慢性肾脏疾病患者尿液及肾脏组织中corin的表达目的：Corin是心脏中发现的一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶，在调节血压和维持心脏功能方面起重要作用。除心脏外，corin也表达于其它组织，如肾脏、骨骼组织、妊娠子宫等。最近有研究发现肾病模型大鼠肾脏中corin表达显著降低，提示corin在肾脏功能中起作用。心脏中表达的corin能从细胞表面脱落，可在血浆中检测到可溶性corin。因此，我们推测肾脏中表达的corin也能脱落，尿液中可能会检测到corin，目前国内外尚无相关研究。本研究通过检测慢性肾脏疾病（chronic kidneydisease，CKD）患者血浆及尿液中的可溶性corin，分析尿液中corin水平与CKD的相关性；同时还检测corin蛋白在CKD患者肾脏组织中的表达及分布，进一步探讨corin参与CKD病理过程的可能机制。方法：1．采集正常人及CKD患者的血液、尿液以及肾脏组织样本。血液标本以EDTA为抗凝剂，离心后获取血浆。2．应用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测了205例正常人与214例CKD患者血浆及尿液中的可溶性corin。3．免疫组化（immunohistochemistry，IHC）方法检测corin蛋白在6例正常人及40例CKD患者肾脏组织中的表达和分布，用Image Pro-Plus软件分析IHC图片中阳性染色区域的平均光密度，评价corin蛋白在正常人及患者肾组织中的表达水平。结果：1．我们首次在正常人尿液中检测到可溶性corin，提示肾脏中表达的corin可从细胞表面脱落。男性尿液中corin的水平明显高于女性（227±107vs.161±108pg/mL，P=0.00003），尿液中corin的水平与年龄不相关。2．在CKD患者中，男性患者尿液中的corin水平显著低于正常男性（156±124vs.227±107pg/mL，P <0.001）；女性患者尿液中的corin水平也低于正常女性，但统计差异不显著（144±112vs.161±108pg/mL，P=0.181）；3．多元线性回归分析结果提示CKD患者尿液corin水平与肾病类型（慢性肾小球肾炎，P <0.001；肾病综合症，P <0.001；系统性红斑狼疮，P=0.004）和肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）（P <0.001）密切相关。舒张压（diastolicblood pressure，DBP）也是一个相关因素（P=0.037）。另外，性别也是尿液corin水平的独立相关因素（P=0.011）。4．尿液corin的水平与CKD分级按照美国肾脏病协会对CKD提出的分期方法，按GFR将CKD患者分为1~5级。我们的分析结果显示，CKD患者尿液中可溶性corin的水平随病情的加重而进行性下降，无论男性和女性，5期CKD患者尿液corin水平均为最低。5．尿液corin的水平与高血压我们的结果还显示，伴高血压患者的尿液corin水平明显低于正常人或不伴高血压的CKD患者，从而提示尿液corin的水平与高血压相关。6．Corin蛋白在肾脏组织中的表达免疫组化结果显示，肾脏中可检测到corin蛋白，主要位于肾小管上皮细胞中，并且CKD患者肾组织中corin蛋白水平显著低于正常对照；免疫组化结果与CKD患者尿液中corin水平低于正常对照的结果一致。结论：1．我们首次在正常人尿液中检测到了corin蛋白，这一结果提示在肾脏表达的corin能被蛋白酶水解脱落。因此，尿液中corin水平可能反映corin在肾脏中的表达水平。2．与正常人比较，CKD患者尿液中可溶性corin和肾组织中的corin蛋白表达水平明显降低。3．在CKD患者中，尿液中corin水平随疾病严重程度而进行性下降，这一结果提示，corin可能在慢性肾脏疾病的发生发展中起一定作用。我们的结果提示，尿液中可溶性corin水平可能为CKD的诊断及评估病情提供新的依据。第二部分妊娠高血压患者corin基因突变检测以及功能研究目的：Corin是心脏中发现的一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶，可将心钠肽前体（pro-atrialnatriuretic peptide，pro-ANP）转化成有活性的ANP，从而调节血压和心脏功能。最新动物模型研究表明corin途径缺陷可能在妊娠高血压发生中起重要作用。本课题中，我们对妊娠高血压患者的corin基因进行测序，筛查corin基因突变，并且进一步研究corin基因突变对其功能的影响及可能的分子机制，从而帮助了解corin在妊娠高血压中的病理分子机制。方法：1．收集124例正常人和65例妊娠高血压患者的血液标本，提取基因组DNA，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增corin基因外显子，测序筛查corin突变基因。2．以人野生型corin质粒为模板，利用定点突变技术构建带有corin基因突变的表达载体。3．将野生型corin及突变体质粒转染人胚肾（human embryonic kidney，HEK）293细胞，制备细胞裂解液，蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测重组corin蛋白的表达及活化情况。4．将corin及pro-ANP表达载体共转染HEK293细胞，免疫共沉淀和Westernblot检测细胞上清中pro-ANP活化为ANP的百分率，评估基因突变对corin功能的影响。5．将野生型corin及突变体质粒转染HEK293细胞，收集细胞培养上清，免疫共沉淀和Western blot检测从细胞膜上脱落下来的可溶性corin片段，研究基因突变对corin在细胞表面表达及水解脱落的影响。结果：1．在65例妊娠高血压患者中发现一例患者的corin基因1507位腺苷酸（A）改变为鸟苷酸（G），导致corin Fz2区472位丝氨酸（Ser，S）突变为甘氨酸（Gly，G），即S472G。我们同时分析了124例正常人的corin基因，未发现此突变的存在，提示该碱基改变为基因突变，而非基因多态性。2．在HEK293细胞表达实验中，S472G突变不影响corin的表达，但明显阻碍了corin的活化。功能研究发现，S472G突变几乎失去了活化pro-ANP的作用，其活性仅为野生型的~10%。3．生物化学和细胞学研究显示，S472G影响corin从细胞膜上脱落的过程。在转染野生型corin的细胞培养上清中可检测到3条可溶性corin条带（~180，~160，~100kDa），而转染S472G的细胞上清中仅检测到1条~95kDa的条带。结论：我们在妊娠高血压患者中发现了一个新的corin基因突变S472G，该突变改变corin的蛋白结构，进而影响其功能。细胞生物学和生化实验显示，该突变使corin活化受阻，失去了活化pro-ANP的能力，并且影响了corin从细胞膜上脱落的过程。我们的结果提示，S472G突变可能参与了妊娠高血压的发生和发展。本研究将有助于了解corin结构和功能的关系，阐述高血压发病的新分子机制；同时，corin介导的ANP活化途径也可能成为妊娠高血压等疾病诊断和治疗的新策略。