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一、研究背景和目的:前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率全球范围内位居男性癌症发病率的第3位,病死率位居第6位。近些年来,中国前列腺癌患者的发病率逐渐升高,其中在城市地区,前列腺癌的发病率在男性常见肿瘤中占第5位和在泌尿系统肿瘤中占第1位。这对男性健康生活构成了极其严重威胁,也给社会带来了巨大的压力。我国前列腺癌的特点是肿瘤分期较晚,远处转移较多。但目前仍无法完全阐明前列腺癌发生发展的分子机制。近年来,随着科学技术的发展,RNA测序(RNA-Seq)技术日益成熟,科学家发现有一种新的内源性非编码RNA类型:环状RNAs(circular RNA,circRNA)。它广泛存在于生物界中,但目前尚无深入研究。研究表明circRNA具有稳定性、组织细胞和发育的时空特异性以及保守性等生物学特性。可以参与RNA-RNA复杂的相互调控网络,在基因的转录后调控中发挥着重要作用。因此,本课题主要围绕前列腺癌有关circRNA展开,研究目的主要探讨为circRNA在前列腺癌发生发展及转移中的生物学作用及分子机制,寻找可预测前列腺癌转移的新的血清学标志物,并为寻找可治疗转移性前列腺癌的分子靶点,为其进一步的精准治疗提供重要的理论依据。二、研究方法:收集我院初诊的前列腺癌患者外周血浆样本118例,其中转移性前列腺癌47例,未发现转移的前列腺癌患者71例。培养正常前列腺细胞RWPE-1,前列腺雄激素依赖性细胞细胞22RV1,前列腺骨转移细胞PC3等多种前列腺肿瘤及正常细胞系。收集RWPE-1,22RV1,PC3细胞的RNA送生物科技公司进行测序。测序结果质控后,进行差异circRNA的筛选,及目的circRNA的确定。对从中筛选出的circRNA-1565进行鉴定,及细胞内亚定位。接着,进行circRNA-1565干扰及过表达载体的构建,及效率检测。用流式细胞术方法检测细胞的凋亡,分别采用CCK8、平板克隆形成实验等研究circRNA-1565对细胞增殖的影响。用流式细胞术检测circRNA-1565对细胞周期的影响。分别用细胞划痕、Transwell小室、血管形成等实验研究circRNA-1565对细胞迁移和侵袭的影响。预测并分析circRNA-1565可能的靶向miRNA。通过RNA免疫共沉淀实验和Luciferase实验,检测miR-21和miR-153是circRNA-1565的靶基因。然后,分别采用细胞划痕Rescue实验、Transwell小室Rescue实验检测circRNA-1565介导的细胞表型能否被miR-21或miR-153恢复。最后,分析并筛选出miR-153的靶基因PI3k。三、研究结果:首先,正常前列腺细胞RWPE-1,前列腺雄激素依赖性细胞22RV1,前列腺骨转移细胞PC3的circRNA表达谱存在差异。我们通过高通量测序,筛选到一条在正常前列腺细胞RWPE-1中极低表达,在前列腺雄激素依赖性细胞22RV1中有一定表达,在前列腺骨转移细胞PC3中高表达的circRNA:circRNA-1565,并在其他细胞系及前列腺癌患者血浆中进行验证。经鉴定,circRNA-1565是一条环状结构完整的全新circRNA。circRNA-1565在细胞主要位于细胞质中。虽然,circRNA-1565不影响前列腺癌细胞的增殖凋亡及细胞周期。但circRNA-1565可促进前列腺癌细胞的侵袭和迁移。随后,我们的研究得出,circRNA-1565可以竞争性结合miR-21和miR-153。miR-153参与circRNA-1565调控的前列腺癌细胞的迁移与侵袭能力。最后,我们发现circRNA-1565通过竞争性结合miR-153调控PI3k的表达。四、结论:本实验通过circRNA高通量测序筛选出一条有功能的全新circRNA:circRNA-1565。通过对前列腺癌患者外周血浆PCR定量检测发现其与前列腺癌的转移有关,细胞功能实验发现circRNA-1565可以促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭。进一步的机制研究发现,circRNA可以竞争性结合miR-153,沉默下游靶蛋白PI3k,从而发挥生物学作用。通过本研究,为寻找新的前列腺癌血浆靶标,寻找治疗转移性前列腺癌的潜在分子靶点提供了新的重要理论依据。