目的：　　分析瘦素与小鼠Treg细胞和Th17细胞生成及功能之间的关联性和可能的机制；观察与肿瘤细胞共培养中Teff细胞和Treg细胞比例和功能的改变；观察肿瘤微环境中瘦素对Treg细胞生成和功能的调节作用，并探讨其与机体肿瘤免疫逃逸的关系。　　方法：　　1、以瘦素基因敲除的ob/ob小鼠和同系野生鼠为研究对象，采用流式细胞术分别检测小鼠外周血、淋巴结和脾脏中Th17细胞和Treg细胞比例；采用免疫磁珠分选两种小鼠脾脏CD4+CD25－细胞，观察该细胞在Th17细胞或Treg细胞诱导培养体系中生成Th17细胞或Treg细胞的比例差异；并在ob/ob鼠细胞中添加瘦素、在野生鼠细胞中拮抗瘦素，观察瘦素对Th17细胞或Treg细胞生成的影响。　　2、采用免疫磁珠分选小鼠脾脏Treg细胞，以CFSE标记Teff细胞，流式细胞仪检测Treg细胞对Teff细胞增殖的抑制功能。　　3、采用流式细胞胞内染色标记技术，检测Treg细胞对Teff细胞产生TNF-α、IFN-γ的抑制作用及瘦素对其作用的影响。　　4、采用流式细胞术检测各种T细胞亚群表面共抑制分子（PD-1、GITR、CTLA-4和Tim3）的表达比例变化。　　5、采用免疫磁珠分选两种小鼠脾脏CD4+T细胞，与同背景小鼠肺癌细胞株LLC进行直接接触和间接接触（Transwell）两种模式的共培养，以模拟肿瘤微环境。以流式细胞仪分析CD4+CD25+T细胞比例、CD4+CD25+T细胞表面共抑制分子表达和TNF-α、IFN-γ分泌等生物学性状的改变；分析Treg细胞比例及其表面共抑制分子表达的变化。　　6、在上述CD4+T细胞与肿瘤细胞共培养体系中拮抗或添加瘦素，进一步观察瘦素对肿瘤环境中Teff细胞和Treg细胞生成及功能的影响。　　7、采用QRT-PCR检测体外实验各种T细胞亚群中Th17细胞、Treg细胞等核转录因子；及其生成和功能密切相关细胞因子等mRNA的相对表达量变化。　　8、采用Luminex多因子检测技术和ELISA技术检测上述体外实验中各种T细胞亚群培养上清液中与Teff细胞和Treg细胞生成和功能密切相关细胞因子的蛋白表达水平变化。　　结果：　　第一部分 瘦素对小鼠Treg细胞和Th17细胞生成及功能的影响及相关机制研究　　1、ob/ob小鼠外周血和脾脏中Th17细胞比例均低于野生鼠（0.53%±0.05%vs1.29%±0.08%、1.79%±0.09%vs2.47%±0.15%），而ob/ob小鼠淋巴结Th17细胞比例与野生鼠比较没有明显改变。ob/ob小鼠外周血和脾脏中Treg细胞比例均高于野生鼠（10.16%±0.53%vs6.29%±0.69%、11.56%±0.72%vs5.47%±0.81%）。ob/ob小鼠脾脏Treg细胞对Teff细胞增殖的抑制作用明显强于野生鼠，对Teff细胞分泌TNF-α和IFN-γ的抑制能力也显著强于野生鼠（1.6%±0.2%vs2.4%±0.5%、4.3%±0.3%vs7.2%±1.2%）。ob/ob鼠添加瘦素Th17细胞比例以剂量依赖的形式增加，并显著降低Treg细胞比例和Treg细胞的抑制功能。野生鼠拮抗瘦素可以明显降低Th17细胞比例，增加Treg细胞比例和抑制功能。　　2、在体外诱导体系中培养96h后，ob/ob鼠CD4+T细胞中RORγt、IL-17A、IL-6和瘦素受体等mRNA相对表达量均低于野生鼠，而Foxp3和TGF-βmRNA相对表达量则高于野生鼠；ob/ob鼠添加瘦素或野生鼠拮抗瘦素可逆转上述结果。ob/ob鼠脾脏CD4+T细胞培养上清液中IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17A的水平显著低于野生鼠，IL-10和IL-22水平则显著高于野生鼠；ob/ob鼠添加瘦素或野生鼠拮抗瘦素可逆转上述结果。IL-9、IL-27、IL-4和IL-23蛋白水平和mRNA表达水平两种小鼠间无明显差异，添加或拮抗瘦素亦不改变结果。　　第二部分 肺癌肿瘤微环境中Treg细胞生成和功能的改变及瘦素的调节作用　　1、与无肺癌细胞同条件的单纯培养相比，C57BL/6小鼠CD4+T细胞间接、直接与肺癌细胞共培养后，CD4+CD25+T细胞比例均显著减少（12.31%±1.91%、7.95%±1.8%vs23.6%±4.12%）；CD3+CD8－T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的阳性率均显著减少；CD3+CD8+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的阳性率亦均显著减少。与无肺癌细胞同条件的单纯培养相比，间接和直接与肺癌细胞共培养后，CD4+CD25+FoxP3+细胞（Treg）比例均显著升高（7.16%±0.73%、7.17%±0.36%vs4.94%±0.45%）；Treg细胞中PD-1+细胞、CTLA-4+细胞比例也显著升高，而GITR+细胞比例仅在直接接触培养中显著升高，Tim-3阳性的比例无明显变化。与肿瘤细胞共培养中，ob/ob鼠Treg细胞及其表面PD-1+、CTLA-4+表达水平也升高，并比野生鼠升高更明显；添加瘦素后上述检测指标下降。野生鼠拮抗瘦素不改变Tr e g细胞比例，但仍可进一步提高PD-1+、CTLA-4+表达阳性比例。肿瘤环境添加或拮抗瘦素对GITR+细胞比例均没有影响。CD4+T细胞与C2C12细胞（对照）共培养均未观察到上述变化。　　2、与单纯培养相比，野生鼠和ob/ob鼠小鼠脾脏CD4+T细胞间接与肺癌细胞共培养后，瘦素受体、RORγt、IL-6和IL-17AmRNA的相对表达量均显著降低，ob/ob鼠降低更为明显；TGF-β和Foxp3mRNA的相对表达量则显著升高，ob/ob鼠升高更为明显。与单纯培养相比，与肺癌细胞间接和直接共培养的细胞上清中，野生鼠和ob/ob鼠IL-10和TGF-β的蛋白浓度均显著升高，ob/ob鼠升高更为明显；TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17A和IL-27水平均显著降低，ob/ob鼠降低的更为明显；IL-22浓度在单纯培养与共培养之间并没有差异，但ob/ob鼠显著高于野生鼠。　　3、在与肿瘤细胞共培养体系中补充瘦素，ob/ob小鼠CD4+T细胞RORγt、IL-17A、IL-6和瘦素受体mRNA相对表达量明显升高，上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17A和IL-27浓度明显升高；而Foxp3和TGF-βmRNA相对表达量明显降低，IL-10、TGF-β和IL-22浓度则明显降低。在共培养体系中加入抗瘦素抗体，野生鼠CD4+T细胞Foxp3和TGF-βmRNA相对表达量明显升高，上清液中IL-10、TGF-β和IL-22浓度明显升高；RORγt、IL-17A、IL-6和瘦素受体mRNA相对表达量明显降低，上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17A和IL-27蛋白浓度明显降低。　　第三部分 小鼠肺癌原位移植瘤模型的建立　　建立了简易、稳定、可重复性好的肺癌原位模型，约2周即可成瘤，并有一定的转移瘤发生率。荷瘤小鼠自然生存4-6周左右，可以保证本课题动物体内实验的顺利实施。　　结论：　　1、瘦素可以通过上调RORγt的表达和转录，促进CD4+T细胞向Th17细胞分化；下调Foxp3的转录和表达，减少Treg细胞的生成，并减弱其对Teff细胞增殖和效应因子产生的抑制能力。这些作用还可能与瘦素调控了与Th17细胞和Treg细胞生成及增殖等相关细胞因子mRNA的转录和蛋白水平的表达相关。　　2、CD4+T细胞与肿瘤细胞共培养后，CD25阳性的比例显著降低，这种降低伴随着共抑制分子的表达增高，效应细胞因子产生的降低，Treg细胞比例显著升高，Treg细胞共抑制分子的表达也升高，免疫抑制性因子产生增多等。表明：在肿瘤微环境中CD4+T细胞的活化和功能均受到明显抑制，这种抑制作用除了肿瘤细胞本身产生的抑制因子外，更多的还体现在共抑制分子的高表达，并与肿瘤细胞表达的共抑制分子配体结合，激活下游信号传导通路，从而进一步加重对T细胞功能的抑制，从而实现免疫逃逸。　　3、从瘦素基因缺陷的ob/ob小鼠获得的CD4+T细胞在与肿瘤细胞共培养后，其免疫抑制状态较野生鼠更为明显。在肿瘤环境中补充瘦素仍可降低Treg细胞的比例和免疫抑制分子的表达及分泌，提高抗肿瘤效应因子的产生，提升机体抗肿瘤的免疫应答。因此，瘦素的干预治疗有望成为肿瘤免疫调控治疗的靶点之一，本研究的结果为此提供了较好的理论和实验依据。