自从27亿年前氧气被放氧光合生物引入大气以来,活性氧就作为生物体的不受欢迎的副产物出现了.生物体内的ROS,不仅包括超氧化物阴离子(O<,2>)和羟自由基(OH),还包括过氧化氢(H<,2>O<,2>)和单线态氧(<1>O<,2>).由于它们有很高的活性和毒性,会对细胞造成氧化毒害,因此所有的需氧生物都进化了一套高效的ROS清除机制.近些年来的研究发现ROS还有其他一些重要作用:控制与调节生物体的生命活动,包括生长、发育、细胞周期,细胞程序性死亡,激素的信号传导,生物或非生物的胁迫应答等.这些研究拓展了我们对ROS的认识,揭示了ROS在植物中的双重作用:有氧代谢的有毒副产物和在植物生长、发育、防御中的关键调节作用. 植物细胞将ROS作为信号分子表明,在进化过程中,植物体已经能够非常好的控制ROS的毒害作用并能把它作为一种信号分子来发挥作用.这一过程的实现需要一个非常大的基因网络来调控,在拟南芥中,这个网络至少包括152个基因,铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)和单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)就是其中的关键酶. 拟南芥一直是研究植物分子生物学途径的最好模式系统,但拟南芥是真正的甜土植物,因此,使用拟南芥将只能揭示关于植物耐盐性较少的信息.最近,另一个盐生植物盐芥被提议为研究植物耐盐性的模式系统,它在cDNA水平上与拟南芥有大约90-95﹪的同源性,因此,可以方便地将拟南芥的很多信息移至盐芥耐盐性的分子生物学研究;盐芥对多种胁迫的耐受能力远远高于拟南芥,它在短时间内能耐受高达500mMNaCl的冲击,在盐适应前后既不产生盐腺也没有复杂的形态上的变化.说明盐芥的耐盐机制很可能与甜土植物类似,只不过有不同的调控模式.因此,比较盐芥和拟南芥活性氧清除酶类的不同表达模式对于研究植物氧化性伤害的产生和应答机制,对了解植物盐胁迫状态下的代谢变化和代谢调节,揭示植物的耐逆机理都具有重要意义. 1.盐芥Cu/ZnSOD2(CSD2)和.MDAR5基因沉默的研究 本实验利用转录后基因沉默技术,对盐芥中两个活性氧清除的关键酶基因CSD2和MDAR5进行沉默的研究,内容主要包括:完成了这2个基因的pGSA1252基因沉默表达载体的构建;并将这2个基因的沉默构建导入了农杆菌GV1101;花序浸泡法进行盐芥的基因转化,收获了大量的种子;以除草剂FINALE进行其转化子的筛选,分别获得了18、16株CSD2和MDAR5基因沉默构建的盐芥转化子;并已初步鉴定了7株盐芥ThCSD2-pGSA1252和10株ThMDAR5-pGSA1252的转基因植株;这些转化子的进一步分子检测正在进行中.本实验目的在于探索这两个基因在盐芥耐盐中的作用. 2.盐芥和拟南芥中盐诱导活性氧清除酶类相关基因的表达模式分析 实时定量PCR是一项灵敏而快速的可应用于基因表达研究的新技术.本研究使用实时定量PCR方法,在盐芥和拟南芥中各进行了30多个与活性氧清除相关基因的表达模式分析,比较二者的不同.结果发现在盐芥中,有超过半数的ROS清除酶基因转录本水平的表达在24小时达到最高,而在其余少半数的ROS清除酶中,几乎所有的表达水平在3小时达到最高的基因都定位于叶绿体,而在拟南芥中并未发现类似规律.