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目的:研究核转录因子Snail在二氧化硅(SiO2)诱导的人支气管上皮细胞(HBE)上皮一间质转型(EMT)中的作用机制。
方法:以200μ g/mlSiO2刺激的HBE细胞为模型,⑴不同时间点(0、1、6、12、18、24h)用倒置显微镜观察HBE细胞形态学改变;⑵不同时间点(0、24h)用电子显微镜观察HBE细胞超微结构改变;⑶不同时间点(0、1、6、12、18、24h)用Western-Blot检测HBE细胞Snail总蛋白表达水平的变化;⑷不同时间点(0、1、6、12、18、24h)用Western-Blot检测HBE细胞Snail核蛋白表达水平的变化;⑸不同时间点(0、1、6、12、18、24h)用免疫细胞荧光检测HBE细胞Snail的核定位情况;⑹不同时间点(0、12、18h)用EMSA检测HBE细胞Snail DNA结合活性的变化情况;(7)RNA干扰Snail的表达后,Western-Blot检测HBE细胞Snail、α-SMA、Vimentin、E-cad蛋白表达水平的变化。
结果:⑴倒置显微镜观察结果显示:HBE细胞与SiO2共育后,随着时间的延长,原呈铺路石样排列的HBE细胞出现梭形、纺锤形改变,间隙略微增宽。⑵电镜结果显示:对照组的细胞大多为圆形,表面微绒毛丰富;SiO2诱导HBE细胞24h时梭形多见,细胞核多形性,细胞表面微绒毛结构减少甚至缺失,代之表现为突起,胞浆内出现大量管状结构,次级溶酶体内可见细胞吞噬的SiO2颗粒。⑶Western-blot检测总蛋白的结果显示:在SiO2作用下,Snail表达随着时间的延长逐渐上调,18h表达达到顶峰,之后逐渐下降;12h组和18h组Snail蛋白的表达水平分别为(2.88±0.63)和(4.51±1.15),与对照组的(0.57±0.04)相比,差异均有统计学意义(P(0.05)。⑷Western-blot检测核蛋白的结果显示:在SiO2作用下,Snail表达随着时间的延长逐渐上调,12h表达达到顶峰,之后逐渐下降;12h组和18h组Snail蛋白的表达水平分别为(4.51±0.81)和(2.76±0.77),与对照组的(0.67±0.15)相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。⑸免疫细胞荧光结果显示:对照组可见到微弱荧光表达于胞浆,核内未见表达;实验组荧光主要表达于细胞核,随着SiO2作用时间的延长,Snail表达逐渐向核内移位。⑺EMSA结果显示:在SiO2作用下,12h组和18h组Snail DNA结合活性的表达水平分别为(0.020±0.00047)和(0.023±0.0011),与对照组的(0.0014±0.00026)相比,差异均有统计学意义(P<0.05),表明SnailDNA结合活性明显升高。⑺siRNA结果显示:①刺激组和干扰组Snail蛋白的表达水平分别为(20.02±1.44)和(6.73±1.03),差异有统计学意义(P<0.05),表明siRNA干扰后Snail表达下调,抑制率为66.38%;②刺激组和干扰组E-cad蛋白的表达水平分别为(0.18±0.03)和(0.84±0.01),差异有统计学意义(P<0.05),表明siRNA干扰后E-cad表达上调:③刺激组和干扰组α-SMA和vimentin蛋白的表达水平分别为(2.35±0.45)和(0.23±0.05),(13.12±1.09)和(2.33±0.54),差异均有统计学意义(P<0.05),表明siRNA干扰后α-SMA和vimentin表达下调,抑制率分别为90.21%和82.24%。
结论:①SiO2可诱导人支气管上皮细胞(HBE)发生上皮-间质转型(EMT);②SiO2可诱导HBE细胞Snail的表达和活化;③Snail参与调节SiO2诱导的上皮-间质转型(EMT)。