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目的:本文以3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠(每组3只)为研究对象,分析小鼠小肠和脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组库的特征,初步探索肠道菌群与小鼠小肠和脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组库的关系,为进一步研究肠道菌群对B细胞发育、分化、增殖与应答的研究,提供参考基础数据,以及提供新的研究思路与技术。方法:1.采集3月龄GF级、SPF级、CL级小鼠(每组3只)的粪便,存于-80度,提取微生物群的DNA,进行16SrDNA建库及Illumina Solexa测序,采用EXCEL软件和Draw Venn Diagram软件等软件,分析GF级、SPF级、CL级小鼠肠道菌群的组成与特征(由华大基因完成)。2.组织切片观察3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠和肠系膜淋巴结的组织结构的形态差异。3.流式细胞仪检测3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠(每组3只)小肠、脾脏、骨髓、外周血中记忆B细胞的比例。4.磁珠分选获取3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠(每组3只)小肠和脾脏的记忆B细胞,流式细胞仪鉴定记忆B细胞的纯度,达到85%以上,QIAGEN试剂盒提取分选获得的记忆B细胞DNA样本,同时提取小肠组织的DNA样本(总B细胞),鉴定各DNA样本浓度和纯度,对每只小鼠样本都采用多重PCR构建BCR H-CDR3 组库,进行 Illumina Solexa 高通量测序(由美国 Adaptive Biotechnologies ImmunoSEQ公司完成)。5.采用 ImmunoSEQ 软件、EXCEL 软件、Draw Venn Diagram 软件、GraphPad Prism5软件等软件,分析3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠的小肠和脾脏记忆B细胞以及小肠总B细胞BCR H-CDR3组库的构成:IGHV、IGHD、IGHJ、V-J配对的基因取用;核苷酸插入删除;IGHV区的高频突变;氨基酸长度;氨基酸的取用分布;共同氨酸序列分析等,从而解析CDR3组库的多样性、克隆性、特异性等组成特征。结果:1.3月龄GF、SPF、CL级BALB/c小鼠粪便中菌群测序Tag/OTU序列数目分别为(每组3只):MGF1:45554/48;MGF2:43787/56;MGF3:45086/38;MSPF1:35225/293;MSPF2:35050/288;MSPF3:35401/287;MCL1:37134/329;MCL2:36610/335;MCL3:36025/302;三组小鼠肠道菌群的多样性存在显著差异(P<0.05),主要表现为CL级小鼠肠道菌群种类最多,多样性最丰富,SPF级次之,其中CL级小鼠比SPF级含有较多的变形菌门,而GF级小鼠粪便中检测到的菌群种类极少而且丰度很低。2.GF级BALB/c小鼠小肠和肠系膜淋巴结组织结构的形态不同于SPF级和CL级小鼠。GF级小鼠主要表现为小肠绒毛密度稀释,绒毛长度相对较长,隐窝深度较深,以及腺体层及基层变薄;肠系膜淋巴结原始生发中心变小,淋巴小结被膜下方,浅皮层淋巴小结之间的弥漫淋巴组织较少。3.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠(每组3只)的骨髓、脾脏、小肠、外周血中记忆B细胞的比例存在差异。主要差异为:与 SPF级和CL级两组小鼠相比,GF级小鼠骨髓中记忆B细胞所占的比例显著降低(P<0.05),而脾脏和外周血中记忆B细胞所占的比例显著升高(P<0.05)。4.3月龄GF、SPF、CL级BALB/c小鼠小肠和脾脏BCR H-CDR3组库HTS总序列数据及分析结果(每组3只)。(1)3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠总B细胞的测序及分析结果(每组3只)。a.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠总B细胞CDR3功能性独特序列/功能性总序列数目(每组3只):MGF1-SI:368/456;MGF2-SI:10612/12772;MGF3-SI:636/945;MSPF1-SI:11346/14556;MSPF2-SI:5636/7639;MSPF3-SI:10614/12422;MCL1-SI:1813/2573;MCL2-SI:1826/2596;MCL3-SI:2372/3485;b.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠总B细胞BCR H-CDR3组库都高频取用 IGHV03-02、IGHV14-02、IGHV09-03、IGHD0J-01、IGHD02-03、IGHJ04-01、IGHJ03-01基因。三组间基因取用频率比较分析结果显示,除IGHD基因的取用无明显差异外,IGHV、IGHJ、V-J配对取用均出现差异,主要差异为:与GF组相比,SPF组和CL组均对IGHV01-09和IGHV15-02基因取用明显降低(P<0.05),均对IGHV03-06基因取用明显升高(P<0.05),与GF组和SPF组相比,CL组对IGHV15-02基因取用都明显降低(P<0.05);与GF组和SPF组相比,CL组对IGHJ04-01基因取用都明显降低(P<0.05);与GF级组相比,SPF组和CL组均对IGHV03-02-IGHJ03-01基因配对取用明显升高(P<0.05)。c.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠总B细胞BCR H-CDR3区氨基酸长度均呈以11-12个氨基酸为中线的钟形分布,都高频取用酪氨酸为代表的疏水性氨基酸。三组间氨基酸的取用存在的主要差异为:与GF组和SPF组相比,CL组对甲硫氨酸的取用都显著降低(P<0.05)。d.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠总B细胞BCRH-CDR3组库多样性(1/DS),未出现明显差异;三组共同的独特氨基酸序列数目为37。三组前10条高频克隆扩增氨基酸序列都存在高度保守的氨基酸基序即“WYFDV”,其中GF组最多。三组间核苷酸插入和删除存在的主要差异为:与其它两组小鼠相比,CL组D5’端核苷酸删除的数目均明显减少(P<0.05),与 SPF组相比,CL组总的核苷酸插入数目显著增加(P<0.05)。三组IGHV基因高频突变的序列存在的主要差异为:与其它两组相比,CL组突变率为400-800区间的序列所占的比例显著升高(P<0.05)。(2)3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠记忆B细胞测序及分析结果(每组3只)。a.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠记忆B细胞CDR3的功能性独特序列/功能性总序列数目(每组3只):MGF1-I:88/89;MGF2-I:352/371;MGF3-I:20/20;MSPF1-I:958/1004;MSPF2-I:1935/2043;MSPF3-I:1843/1949;MCL1-I:2371/2799;MCL2-I:33/35;MCL3-I:146/172;b.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠记忆B细胞BCR H-CDR3都高频取用 IGHV14-02、IGHV03-02、IGHV09-03、IGHD01-01、IGHD02-14、IGHJ04-01、IGHJ03-01基因。三组间基因取用比较分析结果显示,除IGHD基因的取用无明显差异,IGHV、IGHJ、V-J配对基因取用均存在差异,主要差异为:与GF组相比,SPF组和CL组均对IGHV06-06基因取用明显升高(P<0.05);与GF组相比,SPF组对IGHJ04-01基因取用明显升高(P<0.05);与GF组相比,SPF组和CL组均对IGHV03-02-IGHJ03-0 和IGHV14-02-IGHJ04-01基因配对取用明显升高(P<0.05)。c.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠记忆B细胞BCR H-CDR3区氨基酸长度均呈以11-12个氨基酸为中线的钟形分布,都高频取用酪氨酸为代表的疏水性氨基酸。三组间氨基酸取用存在的主要差异为:与GF组相比,SPF组对甲硫氨酸的取用显著升高(P<0.05)。d.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠记忆B细胞BCR H-CDR3组库多样性存在差异,其中GF组和SPF组小鼠小肠记忆B细胞H-CDR3组库的多样性指数(1/SD)差异明显(P<0.05)。三组共同独特氨基酸序列数目为1。三组前10条高频克隆扩增的氨基酸序列都存在两种高度保守的氨基酸基序即“RYFDV”和“WYFDV”,其中GF组“RYFDV”基序最多。三组核苷酸插入和删除存在的主要差异为:与GF组相比,SPF组D3’端核苷酸删除的数目明显增加(P<0.05)。三组IGHV基因高频突变序列所占的比例以及其突变率均未出现显著差异。(3)3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠脾脏记忆B细胞测序和分析结果(每组共3只)。a.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠脾脏记忆B细胞CDR3的功能性独特序列/功能性总序列数目(每组3只)。MGF1-SP:2868/3144;MGF2-SP;173/185;MGF3-SP:688/733;MSPF1-SP:2044/2177;MSPF2-SP:1573/1684;MSPF3-SP:4078/4312;MCL1-SP:4932/5920;MCL2-SP:1454/1755;MCL3-SP:1410/1645;b.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组库都高频取用 IGHV09-03、IGHV03-02、IGHV06-06、IGHD01-01、IGHD02-14、IGHJ04-01、IGHJ03-01基因。三组间基因取用频率比较分析结果显示,除IGHD基因的取用无明显差异,IGHV、IGHJ、V-J基因配对取用均存在差异,主要差异为:与GF组相比,SPF组和CL组均对IGHV05-06-2基因取用明显降低(P<0.05);与GF组相比,SPF组对IGHJ02-01基因取用显著降低(P<0.05);与GF组和SPF组相比,CL组对IGHV05-06-3-IGHJ03-01、IGHV05-15-IGHJ03-01、IGHV06-07-IGHJ03-01基因配对的取用均显著升高(P<0.05)。c.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3区氨基酸长度均呈以11-12个氨基酸为中线的钟形分布,都高频取用酪氨酸为代表的疏水性氨基酸。三组氨基酸的取用存在的主要差异为:与GF组相比,SPF组和CL组小鼠均对组氨酸和甲硫氨酸的取用显著升高(P<0.05)。d.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组库多样性指数(1/DS)逐渐升高趋势,但无明显差异。三组共同独特氨基酸序列数目为15。三组前10条高频克隆扩增氨基酸序列几乎都存在一种高度保守的氨基酸基序即“WYFDV”,其中GF组还存在两种较多保守的基序即“RYFDV”和“GYFDV”。三组的核苷酸插入和删除存在的主要差异为:与SPF组相比,CL组核苷酸插入的数目明显增加(P<0.05)。三组IGHV基因高频突变的主要差异为:与其他两组相比,CL组突变率小于400的序列所占的比例显著降低(P<0.05),大于400的序列所占的比例显著升高(P<0.05)。结论:1.肠道菌群的定植可能影响小鼠小肠和淋巴结的组织结构的发育与成熟,也可能影响记忆B细胞在骨髓、脾脏、外周血的循环分布,推测有可能影响机体B细胞的免疫应答与耐受。2.3月龄GF级、SPF级、CL级BALB/c小鼠小肠记忆B细胞、脾脏记忆B、小肠总B细胞BCRH-CDR3组库的对V基因、J基因、V-J基因配对的取用频率及氨基酸的取用频率均存在显著差异,而且H-CDR3组库核苷酸的插入和删除的数目也均存在差异。3月龄SPF级BALB/c小鼠小肠记忆B细胞BCR H-CDR3组库的多样性指数(1/SD)较GF级显著升高。3月龄CL级小鼠与GF和SPF级相比,其小肠总B细胞IGHV基因发生突变序列的比例显著升高,以及其脾脏记忆B细胞IGHV基因突变序列的突变率也显著升高。3月龄GF级BALB/c小鼠小肠总B细胞和小肠记忆B细胞BCR H-CDR3组库均存在一种高度保守基序分别为“WYFDV”和“RYFDV”基序。