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α,β-不饱和醇是合成香料、香精、原料药等的重要中间体。α,β-不饱和醇的制备主要是通过化学催化剂催化加氢还原α,p-不饱和醛、酮来获得,然而该还原反应的位点选择性较低,并且需要昂贵的金属催化剂。与之相比,生物催化剂由于其天然的位点专一性已越来越受关注。本研究从土壤样品中筛选获得一株催化性能优良的菌株一约克氏菌(Yokenella sp.)WZY002,该菌能选择性还原α,β-不饱和醛、酮得到相应的不饱和醇。在此基础上,对其对应的醇脱氢酶进行了分离纯化,并且完成了酶学性质表征。此外,克隆该醇脱氢酶的编码基因,并在大肠杆菌中成功实现了功能性表达。1.本研究从土壤中筛选获得一株高效的生物催化剂,结合形态、生理生化和16S rDNA分子鉴定等信息,将其命名为Yokenella sp.WZY002。该菌能高效地还原α,β-不饱和醛、酮位点生成α,β-不饱和醇,该反应具有良好的位点选择性。该菌催化还原反应的最适温度和pH分别为30℃和pH 8.0。葡萄糖作为辅助底物能提高还原反应的转化率和得率,反应不需添加辅酶NADP(H)。以50mM的巴豆醛、反-2-己烯醛和苯甲醛等为底物时,该菌催化反应的转化率均大于98%,而且不饱和醇的得率均大于85%。另外,该菌还原2-羟基苯乙酮中生成(S)-型的1,2-二羟基苯乙醇,其产物e.e.值大于99%。该菌能耐受较高浓度的底物,在400mM的巴豆醛为底物时仍然具有催化活力。2.利用离子交换层析、疏水层析及凝胶过滤层析从Yokenella sp.WZY002中纯化得到一个醇脱氢酶,该酶能催化不饱和醛、酮还原生成不饱和醇。纯酶的比活力为25.9U/mg,其亚基大小为37±1kDa。酶催化还原反应的最适温度和pH分别为30℃和pH 7.5。1mM的Na+、Ca2+、Mg2+和K+对酶活力的影响不明显,而1mM的Zn2+、Mn2+和Al3+显著地抑制酶活力。该醇脱氢酶能耐受较高浓度的有机溶剂,20%的乙腈、乙醇、甲醇及丙酮等使相对酶活力提高到142.3-155.8%。虽然40%的甲醇及丙酮不同程度抑制了酶的活力,但其保留活力均大于初始酶活力的85%。Yokenella sp.WZY002醇脱氢酶是严格依赖NADP(H)。当0.4mM NADPH为辅酶时,该酶对苯甲醛的表观Km值和Vmax值分别为0.12mM和35.3U/mg。3.从约克氏菌WZY002基因组DNA中克隆出了编码上述醇脱氢酶的基因,该基因编码339个氨基酸残基。基因信息表明该酶属于中链醇脱氢酶家族成员,其活性中心及辅酶结合位点保守序列分别为G62H63E64X2G67X5G73和G175XG177XXG120。三维结构模拟结果显示其三级结构是由两部分组成,一是含有典型‘"Rossmann"折叠的二核苷酸结合域,另一个是底物结合域。该酶的单体含有两个Zn2+,催化Zn2+位于活性位点附近,而结构Zn2+则处于底物结合域的角落。另外,我们成功地实现了该基因在大肠杆菌中的功能性表达。基因重组菌经诱导破碎后,粗酶比活力为2.1U/mg。