人口老龄化已经成为严重的公共卫生问题。根据流行病学的研究,我国截至2018年底,年龄大于65岁的公民人数将接近1.67亿。随着衰老人口的增加,年龄相关疾病（如心脑血管疾病）也逐渐威胁着人们的健康。血管老化（又称血管衰老）是导致衰老和年龄相关心脑血管疾病的主要危险因素。血管结构改变及内皮功能障碍是血管老化的主要表现。因此探寻改善血管结构及内皮功能的方法或药物对于防治血管老化有重要意义。成体骨髓干细胞--内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）,是一种能通过自身的分化及分泌功能促进血管生成和修复的内皮细胞的前体。越来越多的研究证实,EPCs治疗是一种重要的内源性血管修复策略,可以作为治疗内皮完整性和功能紊乱相关疾病的手段。自体EPCs移植和通过药物动员EPCs有助于血管修复和新生血管形成。此外,在针对动物和人类的研究中已证明,EPCs的数量和/或功能活动因衰老而受损。因此探索及挖掘改善自体EPCs衰老的研究对于延缓衰老有重要意义。线粒体的功能障碍对于机体的衰老有着重要的影响。线粒体作为一个重要的细胞器,维持其内部的结构完整性和稳态是极其关键的。线粒体通过融合和裂变不断发生数量和形态的变化。这种“线粒体动力学”通过线粒体内容的有效运输和分布,有助于维持细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的水平,在细胞衰老的进程中起着重要的影响。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是一种中枢代谢传感器,可被多种线粒体损伤激活,包括线粒体裂变。激活AMPK可以抑制线粒体分裂蛋白的线粒体异位,减少线粒体的破碎和ROS的产生,改善衰老引起的功能障碍。AMPK水平及活性在衰老过程中也存在下降的现象。气血是构成人体的基本物质,而气血不和,血脉阻滞是衰老的危险因素。本研团队的前期研究已证明,益气活血中药人参三七川芎提取物（Ginseng-Sanqi-Chuanxiong extracts,GSC）在改善内皮细胞功能,延缓血管老化方面有很好的疗效,但对于GSC改善EPCs衰老抑制血管老化的作用和机制研究,目前尚未开展。因此,本研究通过体内实验构建D-gal诱导的血管老化小鼠模型观察GSC对小鼠主动脉和EPCs功能及衰老的保护作用;体外实验,通过D-gal诱导构建EPCs衰老模型研究GSC对EPCs线粒体功能及线粒体融合分裂相关指标的影响,并以AMPK抑制剂干扰EPCs中AMPK的表达,进而探讨GSC通过调控AMPK通路对EPCs衰老的保护机制。基于体外实验的结果,从自体移植的角度,将体外GSC干预D-gal诱导血管老化小鼠的EPCs,移植进血管老化小鼠的体内,观察GSC通过干预EPCs改善小鼠主动脉衰老的疗效及机制。实验一 GSC对D-gal诱导小鼠主动脉老化及EPCs衰老的影响目的:探究GSC对小鼠主动脉衰老及EPCs功能的影响。方法:将 48 只 C57 BL/6N 小鼠随机分为 Control、Model、GSC-L、GSC-M、GSC-H和Met组,通过D-gal颈背部注射11周诱导血管老化小鼠模型,在造模第3周给予纯水、Met及GSC灌胃处理。通过HE染色、Elisa检测和免疫组化评价小鼠主动脉衰老的情况。对小鼠骨髓细胞进行诱导培养,通过细胞形态、免疫荧光、CCK-8、Transwell、黏附实验及Elisa对EPCs进行鉴定和功能的评价。通过SA-β-gal染色及衰老蛋白的Western blot检测评价细胞衰老的情况。结果:D-gal的连续性干预能够引起小鼠主动脉结构紊乱及IMT增加（P＜0.001）,升高体内氧化应激的水平,造成SOD降低和MDA升高（P＜0.05）,使小鼠内皮功能受损,引起NO降低及ET-1升高（P＜0.05）,并且小鼠主动脉出现硬化和衰老蛋白堆积,使AGE、MMP-2及P53的表达升高（P＜0.05）。GSC-L、GSC-M及GSC-H组能不同程度的改善小鼠主动脉血管的主动脉结构,降低IMT（P＜0.01）,提高SOD及NO含量（P＜0.05）、降低MDA及ET-1水平（P＜0.05）,减少主动脉AGE、MMP-2及P53的表达（P＜0.05）。并且GSC-H组的改善趋势更明显。经过细胞形态、FITC-UEA-I及Dil-ac-LDL双荧光染色阳性,CD34、CD133及CD309的表达阳性,证明了提取诱导的细胞为EPCs。与Model组相比,GSC-L、GSC-M及GSC-H能不同程度的改善EPCs的功能,提高细胞增殖率、迁移细胞数量、黏附细胞数量、NO、VEGF及SDF-1的含量（P＜0.05）,并且缓解EPCs的衰老,降低SA-β-gal染色率（P＜0.01）、下调P53、P21和P16的蛋白表达（P＜0.05）。与GSC-L及GSC-M相比,GSC-H的改善趋势更明显。结论:GSC能够改善D-gal的诱导小鼠主动脉衰老所引起的主动脉病理变化、氧化应激水平、内皮功能、血管硬化及衰老蛋白堆积。并且GSC能改善血管老化小鼠体内EPCs的细胞衰老及增殖、黏附、迁移及NO、VEGF和SDF-1分泌功能的减弱。提示GSC或许是通过抑制小鼠体内EPCs的衰老,改善EPCs的生物学功能,进而延缓D-gal诱导的小鼠主动脉血管老化。实验二 GSC对D-gal诱导的衰老EPCs线粒体融合-分裂动态平衡的影响目的:通过研究GSC对衰老EPCs线粒体融合分裂的影响,探索GSC延缓EPCs衰老的机制。方法:参照实验一对EPCs进行提取诱导,通过CCK-8及SA-β-gal筛选不同浓度的D-gal、GSC及Met的最佳体外造模及干预浓度。将细胞分为Control组、Model组、GSC组及Met组。Western blot检测各组衰老蛋白的表达。通过检测各组mtROS的含量、线粒体膜电位的水平、ATP含量及Mitotracker染色评价各组线粒体功能及形态的差异。通过qPCR及Western blot检测线粒体融合分裂相关mRNA及蛋白的表达,探索GSC对线粒体融合分裂蛋白及基因表达的影响。结果:最终确定20g/L、200mg/L及8mM为D-gal、GSC及Met的最佳干预浓度。体外实验验证了,GSC及Met能改善D-gal诱导EPCs衰老所引起的细胞活性降低（P＜0.05）,SA-β-gal染色率及衰老蛋白P53、P21、P16蛋白的表达的升高（P＜0.05）。并且与Model组相比,GSC及Met能够明显降低mtROS水平（P＜0.01）、提高线粒体膜电位（P＜0.05）及ATP含量（P＜0.01）。线粒体形态方面,Model组的线粒体形态呈现云雾及颗粒状,Control、GSC及Met组可见明显的线粒体棍棒状结构,提示D-gal诱导的EPCs衰老会引起线粒体的过度分裂,而GSC及Met能抑制其碎片化。通过Western blot及qPCR对线粒体形态的结果进行验证发现:与Model组相比,GSC及Met能明显降低线粒体分裂相关蛋白及mRNADrp1、Mff及Fis1的表达（P＜0.05）。结论:GSC能够改善D-gal诱导小鼠骨髓源EPCs的衰老所引起细胞活性的减低,SA-β-gal、P53、P21及P16蛋白的升高、线粒体的过度分裂及线粒体功能障碍。提示GSC或许能够通过抑制Drp1介导的线粒体分裂延缓D-gal诱导的EPCs的衰老。实验三 基于AMPK通路调控线粒体分裂探讨GSC延缓D-gal诱导EPCs衰老的机制研究目的:观察GSC对衰老EPCs AMPK通路蛋白的影响。通过AMPK抑制剂（Compound C）干扰AMPK的表达,进一步探讨GSC调控AMPK通路延缓EPCs衰老的作用机制。方法:在实验二的基础上,将Compound C组分为Control+C.C组、Model+C.C组、GSC+C.C组及Met+C.C组,其余分组同实验二。使用Western blot检测AMPK及 p-AMPK 的表达。通过 CCK-8、transwell、黏附实验、SA-β-gal 染色、ROS、线粒体膜电位、ATP来评价细胞功能及线粒体功能。通过Western blot检测P53、P21、P16、Drp1及Fis1的蛋白表达来评价细胞衰老及线粒体分裂。结果:与Model组相比,GSC及Met组p-AMPK/AMPK比值升高（P＜0.05）。经过Compound C干扰各组AMPK的表达后,GSC+C.C及Met+C.C组的细胞增殖率、细胞迁移数量、细胞黏附数量、mtROS活性、线粒体膜电位水平、ATP含量、线粒体形态、SA-β-gal 染色、P53、P21、P16、Drp1、Fis1、AMPK、p-AMPK的蛋白表达与Model+C.C相比无统计学差异（P＞0.05）。结论:GSC可以通过激活AMPK通路抑制Drp1介导的线粒体分裂改善D-gal诱导的EPCs衰老。实验四GSC体外干预衰老EPCs改善D-gal诱导小鼠主动脉衰老的疗效初探目的:观察GSC对自体EPCs移植改善小鼠主动脉衰老的干预作用。方法:造模前将小鼠随机分为Control组及Model组,同实验一的造模方法,将Model组小鼠随机分为移植组,模型空白组（Model）,模型移植组（Model+M）,中药移植组（Model+G）,二甲双胍移植组（Model+Met）。造模后,将移植组小鼠的EPCs经过体外药物干预后,按照每只注射1×106个细胞进行尾静脉移植。移植14天后,记录小鼠的一般情况,免疫组化检测小鼠主动脉VEGF的表达。Western blot检测主动脉P53及P21蛋白的表达。同实验一的检测方法进行具体指标检测。结果:最终Model组尾静脉注射成功10只,Model+M组成功8只,Model+G组成功9只,Model+Met组成功10只。各组小鼠未出现精神异常及死亡。与Model组相比,Model+M组的一般状况无明显差异,Model+G组及Model+Met组更为活泼,行为敏捷;Model+M组、Model+G组及Model+Met组能不同程度的改善主动脉结构紊乱、提高SOD及NO含量、降低MDA及ET-1含量、下调AGE、MMP-2、P53 及 P21 的表达（P＜0.05）,并且 Model+G 及 Model+Met组的上诉指标改善趋势较Model+M组更加明显。但是,Model+M组、Model+G组及Model+Met组VEGF的表达较Model组无明显差异（P＞0.05）。结论:GSC体外干预对EPCs移植改善D-gal诱导血管老化的病理变化、内皮功能及衰老蛋白的表达有更明显的改善作用,但具有一定的局限性,其移植方案及机制还需要进一步优化及研究。综上所述,通过构建D-gal诱导的血管老化小鼠模型及体外诱导的EPCs衰老模型,证明了 GSC在延缓小鼠主动脉衰老的同时可以改善EPCs的衰老、功能和线粒体融合-分裂动态平衡的变化,并通过AMPK抑制剂的干扰,进一步揭示了 GSC可以通过调控AMPK通路抑制Drp1介导的线粒体分裂进而延缓EPCs的衰老。通过GSC体外干预自体EPCs的研究发现,EPCs自体移植能改善血管老化,而GSC的体外干预能促进移植的疗效。本研究率先从AMPK介导的线粒体分裂的角度探索GSC对D-gal诱导小鼠血管老化及EPCs衰老的保护作用及机制,并将其应用到血管老化的移植治疗中,既往鲜见报道,同时也为中医药促进干细胞治疗,防治血管老化提供了新的思路。