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转录因子结合谱是指转录因子能够特异性识别结合的所有DNA序列以及转录因子对这些DNA序列结合的相对亲和性。绘制转录因子DNA结合谱对研究转录因子DNA结合特异性及预测转录因子DNA靶点具有重要价值。目前将传统的指数富集配体进化技术(SELEX)技术与先进的DNA大规模平行测序技术结合而产生的SELEX-Seq技术已经成为绘制转录因子DNA结合谱最好的方法。
核因子κB(NF-κB)是一种序列特异性真核转录因子,与细胞免疫应答、炎症反应和肿瘤发生关系密切,是目前转录治疗的药物筛选靶点之一。因此,为了充分了解NF-κB的DNA结合特征、预测其DNA靶点,本论文采用SELEX-Seq技术进行了NF-κB p50蛋白的高分辨率DNA结合谱的绘制研究。
实验中首先根据NF-κB的DNA结合位点核苷酸个数(10nt)设计并合成含有10-nt随机序列的单链寡核苷酸文库,文库中每一寡核苷酸的两端为PCR引物退火序列；之后用引物退火,再用DNA聚合酶延伸的方法,将单链寡核苷酸转变成双链寡核苷酸文库。对双链寡核苷酸文库进行凝胶迁移实验法SELEX筛选,富集NF-κB p50蛋白结合DNA分子。经4轮SELEX筛选富集后,获得的富集DNA分子进行Solexa大规模平行测序,获得9667032个读序片段(reads)。
对reads进行净化处理,去除PCR引物及T5错误reads,获得7292238个reads进入生物信息分析。通过对大量reads的抽样法MEME分析,获得NF-κB p50 DNA结合模体(motif)。通过各reads频率统计获得NF-κB p50对各种DNA序列的相对结合亲和性,并选取不同亲和性序列用近红外荧光EMSA实验验证其相对亲和性。由此获得转录因子NF-κB p50蛋白高分辨率DNA结合谱。
本论文通过SELEX-Seq技术建立的NF-κB p50蛋白高分辨率DNA结合谱为下一步全基因组DNA中NF-κB的DNA结合靶点及靶基因的预测和鉴定提供了重要数据。同时,本论文证明:(1)凝胶迁移实验法SELEX筛选可有效地用于转录因子DNA结合谱研究；(2)对大量reads的抽样法MEME分析可有效地从SELEX-Seq reads中提炼转录因子DNA结合模体。