目的:创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的发病率、致残率和致死率高,而且很难控制原发性损伤,因此控制TBI后的继发性脑损伤成为提高患者预后的重要干预靶点。TBI后继发的凝血功能障碍(traumatic brain injury-associated coagulopathy,TBI-AC)及过度免疫炎症反应是患者伤后致死致残的重要原因,但目前机制尚不明确、临床治疗效果不佳。本课题组前期研究结果显示,TBI后脑源性微粒(brain derived microparticles,BDMP)可大量释放进入循环血,通过激活凝血通路及血小板导致消耗性凝血功能障碍和出血。本次研究将在此基础上,重点研究Lactadherin蛋白能否能增强并加速BDMP的清除,预防或减少TBI-AC的发生,改善TBI的预后及其机制。本研究将丰富对BDMP清除机制的研究,并为治疗TBI-AC及TBI后继发性损伤提供新方法。方法:(1)通过小鼠TBI模型,鼠尾静脉注射Lactadherin观察其是否能降低死亡率并改善TBI的预后。(2)通过伊文思蓝染色观察小鼠TBI模型鼠尾静脉注射Lactadhein能否减少血脑屏障的渗漏。(3)通过磷钨酸-苏木精染色观察小鼠肺组织的纤维素沉积(4)通过ELISA检测血浆中D二聚体的含量变化及通过凝血因子Xa凝血时间实验检测Lactadhein能否减少TBI-AC的发生。(5)通过全血细胞计数研究TBI后血细胞含量的变化。(6)通过流式细胞术检测TBI后血浆中BDMP的含量变化。(7)通过ELISA检测小鼠血浆内Lactadherin蛋白在TBI前后的含量变化。(8)伤后给予Lactadherin蛋白研究使用Lactadherin蛋白治疗的可行性。(9)注射生物素标记的BDMP,并做组织病理染色,明确BDMP的清除途径。(10)通过流式细胞术检测MP,Lactadherin及白细胞复合体的形成。(11)利用Lactadherin基因敲除小鼠及其同窝小鼠验证实验。(12)利用基因蛋白工程技术研究Lactadherin蛋白发挥作用的机制。(13)体外Transwell实验检测Lactadhein能否减少BDMP导致的内皮细胞间的渗漏。(14)体外流式细胞术验证Lactadherin蛋白发挥作用的机制。(15)利用可视流式系统Amnis Image Stream X?Mk II观察mt MP与单核细胞的结合,并尝试阻断其可能的结合位点。结果:(1)注射Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠的死亡率,改善预后,降低血脑屏障渗漏,减少肺组织纤维素渗出。(2)体外Transwell实验也证实Lactadherin蛋白能减少内皮细胞间的渗漏(3)注射Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠血浆中的BDMP含量,减少血小板的消耗,改善血液的高凝状态。(4)ELISA结果显示TBI后血浆中正常分泌的Lactadherin蛋白含量升高但不足以清除大量释放的BDMP。(5)TBI后给予充足的Lactadherin蛋白能有效地帮助BDMP清除,改善小鼠预后。(6)生物素标记的BDMP定位实验显示Lactadherin蛋白能增加BDMP在肝脏被巨噬细胞清除的量,同时体外实验也能观察到Lactadherin蛋白能促进巨噬细胞粘附吞噬BDMP。(7)通过流式细胞术观察到Lactadherin蛋白主要结合在BDMP的PS上(8)单纯的Lactadherin蛋白的C1C2片段对BDMP的清除能力十分有限,提示Lactadherin蛋白上的EGF片段(该片段能与巨噬细胞上的αvβ3和αvβ5整合素受体结合)是不可缺少的部分。结论:(1)注射Lactadherin蛋白能通过降低血脑屏障渗漏、减少肺组织纤维素渗出、改善血液的高凝状态等几方面减少TBI小鼠的死亡率,改善预后(2)正常分泌的Lactadherin蛋白量较少不足以清除TBI后大量释放的BDMP。(3)Lactadherin蛋白能有效地帮助BDMP与巨噬细胞结合促进吞噬。(4)Lactadherin蛋白的C1C2片段能与BDMP上的PS相结合,EGF片段能与巨噬细胞上的αvβ3和αvβ5整合素结合,要充分的发挥清除作用二者缺一不可。本研究发现了Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠的死亡率,改善预后,并揭示了Lactadherin蛋白清除BDMP的机制,为临床治疗TBI后的继发性损伤提供了新的治疗的方法和理论基础。