一.立题目的和依据人高迁移率族B1 (high mobility group box 1, HMGB1)是含有215个氨基酸序列在哺乳动物细胞中广泛表达的高度保守的蛋白,因其相对分子质量小(M<30000),在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移而被命名。HMGB1包括3个不同的功能区,其N-端包含2个结构域：HMBG A box和HMBG B box,均由约80个氨基酸残基构成,富含带正电荷的赖氨酸呈较强的碱性,为DNA非特异结合区；酸性C-末端包含超过30个连续的天冬氨酸和谷氨酸残基,籍以完成与其它蛋白质间相互作用及调节HMGB1与DNA结合。HMGB1蛋白在胞内外都有分布,根据其分布不同而发挥不同的生物学效应。人和小鼠的HMGB1只有两个氨基酸的差异,HMGB1缺陷的小鼠在出生后几个小时内就会死亡,说明HMGB1蛋白在维持细胞功能方面起着重要的作用。细胞内HMGB1参与构建核小体,该蛋白和DNA的小沟结合后改变DNA双螺旋构型,增加转录因子和DNA相互作用的亲和力调节DNA的转录,同时在DNA重组、复制和修复中亦起重要的辅助作用。细胞外HMGBI具有细胞因子特性,它与细胞分化、迁移、增殖、凋亡以及炎症反应的诱导等密切相关。尽管HMGB1蛋白缺少引导肽,且不能穿出内质网和高尔基细胞器,但仍可通过以下两种途径释放,一是由坏死但未凋亡的细胞释放,一是炎性因子刺激细胞后由细胞主动分泌,这些细胞如：巨噬细胞、NK细胞等。研究表明,HMGB1与炎细胞表面的RAGE、TLR-2、TLR-4等受体相互结合后可引发MAPK的磷酸化、核转录因子NF-κB和活化蛋白-1的核内转移,使许多炎性因子如IL-1β、TNF-α、IL-8等表达加强和释放增多而启动炎症反应或使炎症恶化。当细胞坏死或受损时,在TNF的作用下核内的HMGB1可释放到胞外,引发单核巨噬细胞分泌促炎因子；而促炎因子又可进一步促进HMGB1的分泌,形成正反馈环。在炎性反应的后期,这种正反馈效应对SLE等疾病炎性反应的维持具有重要的作用。在培养的巨噬细胞中分别加入HMGB1和B box蛋白,结果显示经二者刺激后均有较高水平的TNF-a的产生,使用抗B box蛋白的抗体后显示二者的TNF-a的产生水平明显降低,表明HMGB 1的致炎作用主要是由其B box结构域来行使,并且单独B box即可发挥致炎作用。同样在巨噬细胞中加入A box蛋白后可以明显降低HMGB1刺激后TNF-a的产生水平。表明A box蛋白起到了抑制炎症的作用成为HMGB1有效的拮抗剂。为探讨HMGB1 A box在SLE等自身免疫病中的治疗作用,我们进行了其表达载体构建、重组蛋白纯化和生物学活性的研究。二.方法和结果1.成熟人HMGB1 A box的基因克隆及序列分析根据GenBank报导的成熟人HMGB1编码序列对其进行优化,调整密码子适应指数(Codon Adaptation Index, CAI)使得CAI数值为0.95,增加编码序列中GC含量延长mRNA的半衰期,去除mRNA的二级结构,全基因合成质粒DNA pUC 57-HMGB1。根据优化后的HMGB1基因序列我们设计合成了扩增HMGB1 A box基因片段引物,分别在上下游引物5′端加上限制性酶切位点Nde I和Xho I,以优化后的HMGBl基因序列为模板,用Taq DNA聚合酶扩增HMGB1 A box基因片段。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,胶回收试剂盒回收分离目的基因片段。将目的基因片段插入克隆载体pMD19-T,转化大肠杆菌DH5a,接种于含10Oug/mL氨苄青霉素的LB平板。菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆,采用ABI3100-Avant Genetic Analyzer全自动DNA测序仪测序,结果显示,克隆的基因序列和优化后的成熟人HMGB1 A box基因序列完全一致。成功构建了人HMGB1 A box的重组质粒pMD19-T-HMGB1 A box.2.人HMGB1 A box的基因在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的鉴定用Nde I和Xho I双酶切消化重组质粒pMD 19-T-HMGB 1 A box,低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化HMGB1 A box基因片断,插入原核表达载体pQE-T7-2的相应位点构建重组pQE-A box表达载体。重组子转化大肠杆菌DH5α(EcoliDH5a),接种于含50ug/mL卡那霉素(Kanamycin)的LB平板,菌落PCR鉴定阳性重组。挑选阳性重组的单个菌落接种于含有50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中,提取质粒再转入大肠杆菌BL21感受态。挑选单个菌落接种于含有50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃震荡培养过夜,按1：100的比例稀释后接种于含卡那霉素抗性的LB液体培养基中震荡至对数生长期,加入IPTG诱导4小时,离心收集菌体行SDS-PAGE和Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示诱导后pQE-A box阳性重组菌株在相对分子量(Mr)约为14000处可见一明显蛋白条带,与预期蛋白大小相符,图像扫描仪分析显示目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。Western blotting显示重组蛋白能与抗人HMGB1多克隆抗体和抗His-Tag多克隆抗体发生特异性反应,表明重组蛋白为特异性人HMGB1 A box蛋白。3.人HMGB1 A box蛋白的纯化及生物活性测定收集菌体,冰浴中超声裂解,离心收集上清。沉淀经0.5%triton X-100洗涤即为粗提的包涵体。7M尿素溶解包涵体离心后收集上清,超声后上清及包涵体裂解产物行SDS-PAGE。结果显示重组蛋白存在于上清中,提示HMGB1 A box以可溶性形式表达于菌株胞浆。经Ni2+-NTA层析柱纯化后SDS-PAGE检测纯化后的蛋白,结果显示重组蛋白HMGB1 A box纯度达90%以上。透析纯化后的蛋白去除咪唑等小分子物质。按文献制备细胞坏死液,免疫复合物(IC)由细胞坏死液与SLE患者血清以25：1的比例配制。U937细胞(3×108／L)接种于12孔板,1 ml／孔。实验分U937细胞+IC组,U937细胞+IC+HMGB1 A box组,每组设3个复孔。于37℃50ml/L CO2条件下孵育24 h。收集细胞,提取总RNA, RT-PCR检测细胞IFN-γ、BAFF及TNF-α水平,同时以GAPDH为内参照。PCR产物琼脂糖凝胶电泳图像经凝胶图像扫描仪扫描并分析,采用相对指数(Relative index,RI)计算BAFF、IFN-γ及TNF-a的表达水平。结果显示HMGB1 A box蛋白可有效抑制IC刺激单核细胞后BAFF、TNF-a及IFN-y的分泌,提示所制备的人HMGB1 A box蛋白具有显著的生物活性。三.结论1.成功克隆了人HMGB1 A box基因,序列分析显示,克隆的基因序列和优化后的基因序列一致。2.构建了人HMGB1 A box的原核表达载体,获得稳定表达的工程菌株。3.初步摸索优化了重组人pQE-A box的表达条件、包涵体提取步骤,蛋白初步纯化工艺。3.重组人HMGB1 A box蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%左右,为特异性人HMGB1 A box蛋白。制备的人HMGB1 A box蛋白具有显著的生物活性。