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脱氢乙酸钠（sodium dehydroacetate,Na-DHA）常作为防腐剂应用于食品、饲料和化妆品中。但研究发现反复口服Na-DHA可导致大鼠体重和采食量下降,多脏器明显出血,血清维生素K（vitamin K,VK）水平降低,凝血酶原时间（prothrombin time,PT）和活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time,APTT）延长,肝脏中维生素K环氧化物还原酶复合物亚基1（vitamin K epoxide reductase complex subunit 1,VKORC1）和 VKORC1-样蛋白1（VKORCl-like protein 1,VKORC1L1）的表达被抑制。VKORC1主要分布在肝脏,而VKORC1L1主要在肝外组织。但Na-DHA对大鼠肝细胞中VK和凝血因子的影响,及VKORC1和VKORC1L1在其中的调控作用,目前并不清楚。本研究以慢病毒为载体,分别构建过表达VKORC1和VKORC1L1的BRL3A大鼠肝细胞稳转细胞系,在体外研究Na-DHA对大鼠肝细胞中VK和凝血因子Ⅸ（factor Ⅸ,FIX）的影响及VKORC1和VKORC1L1在其中的调控作用,为Na-DHA所致凝血障碍的作用机制研究提供理论依据,也为探寻相应的药物防治提供参考。在慢病毒感染条件的选择中,以1.0～5.0 μg/mL聚凝胺（polybrene）处理BRL3A细胞24 h,大于2.0 μg/mL的polybrene均对BRL3A细胞产生毒性作用,因此选择2.0μg/mL polybrene用于后续慢病毒的感染。以0～40感染复数（multiplicity of infection,MOI）的空载体慢病毒（LV5-NC）感染BRL3A细胞96h后,30 MOI时,标签绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）的表达最高,因此选择30 MOI慢病毒用于后续稳转细胞系的构建。在稳转细胞系的构建中,以0.5～2.5 μg/mL嘌呤霉素处理BRL3A细胞3d,高于1.5 μg/mL时,BRL3A细胞几乎全部死亡,因此选择1.5 μg/mL嘌呤霉素用于后续稳转细胞系的筛选。用30 MOI过表达大鼠Vkorc1和Vkorc1l1的慢病毒（LV5-Vkorc1和LV5-Vkorc1l1）与 2.0 μg/mL polybrene 感染 BRL3A 细胞 96 h 后,经 1.5 μg/mL 嘌呤霉素筛选7d,分别获得VKORC1和VKORC1L1过表达BRL3A稳转细胞系（命名为BRL3A-VKORC1 和 BRL3A-VKORC1L1 细胞）,通过荧光观察、反转录 PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）分别检测 GFP、VKORC1和VKORC1L1的表达。结果显示,BRL3A-VKORC1和BRL3A-VKORC1L1细胞均有较高的GFP表达,且细胞中VKORC1和VKORC1L1蛋白水平分别提高了约72.8%和53.2%（P＜0.01）,表明VKORC1和VKORC1L1过表达BRL3A稳转细胞系构建成功。在采用MTT和EdU试验检测Na-DHA对BRL3A细胞生长的影响中,2.0和5.0 mmol/LNa-DHA处理BRL3A细胞24 h,对细胞活力和增殖均无显著影响,但10.0 mmol/LNa-DHA处理BRL3A细胞24h,显著降低细胞活力（P＜0.001）和增殖（P＜0.05）,因此选择5.0 mmol/LNa-DHA用于后续试验。5.0 mmol/L Na-DHA处理细胞24 h后,BRL3A细胞中Vkorc1和Vkorc1l1及BRL3A-VKORC1L1 细胞中 Vkorc1l1 mRNA 水平无显著影响,但 BRL3A-VKORC1 细胞中Vkorc1 mRNA 水平极显著降低（P＜0.01）;BRL3A 及 BRL3A-VKORC1 或BRL3A-VKORC1L1细胞中VKORC1或VKORC1L1蛋白水平均显著降低（P＜0.05）;BRL3A-VKORC1 或 BRL3A-VKORC1L1 细胞中 VKORC1 或 VKORC1L1 的 mRNA 和蛋白水平均极显著高于BRL3A细胞（P＜0.01）。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,EL.ISA）法检测细胞和培养液中VK和FIX含量,PBS处理时,BRL3A-VKORC1和BRL3A-VKORC1L1细胞中VK和FIX含量与BRL3A细胞相比无显著差异,但两者培养液中VK和FIX含量极显著高于BRL3A细胞（P＜0.01）;5.0 mmol/LNa-DHA 处理细胞 24 h 后,BRL3A、BRL3A-VKORC1 和 BRL3A-VKORC1L1细胞和培养液中VK和FIX含量均显著下降（P＜0.05）,BRL3A-VKORC1和BRL3A-VKORC1L1细胞中VK和FIX含量与BRL3A细胞相比无显著差异,但两者培养液中VK和FIX含量均显著高于BRL3A细胞（P＜0.05）。综上所述,本研究成功构建了 VKORC1和VKORC1L1过表达BRL3A稳转细胞系,在mRNA和蛋白水平均能分别稳定过表达VKORC1和VKORC1 L1。Na-DHA对BRL3A细胞中Vkorc1和Vkorc1l1 mRNA水平无显著影响;能显著降低VKORC1和VKORC1L1蛋白水平;显著抑制BRL3A细胞中VK和FIX的生成和分泌。VKORC1和VKORC1L1过表达能提高BRL3A细胞VK和FIX的生成和分泌,并能缓解Na-DHA对BRL3A细胞中VKORC1和VKORC1L1表达及VK和FIX水平的抑制作用。结果表明,VKORC1和VKORC1L1在Na-DHA对BRL3A细胞VK和FIX影响的过程中均发挥调控作用,调控VKORC1或VKORC1L1活性对于减轻Na-DHA所致的凝血障碍具有重要意义。