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研究背景多发性肌炎(polymyositis,PM)是一种特发性炎性肌病,病程迁延,严重时可致残、致死。迄今为止其确切病因和发病机制未明,目前治疗主要依靠全身性免疫抑制治疗,但此类药长期使用副作用较多,且仍有相当一部分难治性病例对此类药物治疗无效。NLRP3(NACHT,LRR and PYD domain-containing protein 3)炎性小体是一类多蛋白复合物,近年来研究发现NLRP3炎性小体不仅在固有免疫应答中起核心作用,还通过调控免疫细胞的分化与功能等在自身免疫病的发病中起重要作用。NLRP3炎性小体活化后能激活半胱天冬酶-1(caspase-1),进而裂解白介素-1β(Interleukin-β,IL-1β)使之成为成熟的细胞因子IL-1β调控炎症反应。NLRP3炎性小体/caspase-1/IL-1β信号轴在多种感染及免疫相关疾病中的作用已被证实,亦有文献报道PM患者肌肉组织中NLRP3炎性小体、caspase-1及IL-1β表达增高,提示PM和该信号轴有相关性,但具体机制不明。因此,本课题从PM患者肌肉组织、PM大鼠模型、细胞培养等三个层面,研究NLRP3炎性小体/caspase-1/IL-1β信号轴在PM发病中的作用,探讨NLRP3炎性小体/caspase-1/IL-1β信号轴在调控PM发病中的可能机制,以期深入理解PM的免疫病理机制,为新的治疗策略提供理论依据。第一部分NLRP3炎性小体/caspase-1/IL-1β信号轴在多发性肌炎患者肌肉组织中的表达研究目的:通过检测NLRP3炎性小体、caspase-1、IL-1β在PM患者受累肌肉组织中的表达,明确NLRP3炎性小体/caspase-1/IL-1β信号轴和PM之间的相关性。研究方法:回顾性分析我中心2007年5月至2016年10月就诊的24例PM患者和10例对照患者。搜集临床资料、HE染色观察两组患者肌肉组织学炎症等级,同时用免疫组化检测PM组和对照组肌肉组织中NLRP3炎性小体、caspase-1、IL-1β及CD68+巨噬细胞表达;比较两组炎症组织学评分、NLRP3炎性小体、caspase-1、IL-1β阳性表达和巨噬细胞浸润程度差异;分析NLRP3炎性小体、caspase-1、IL-1β表达与炎症等级、巨噬细胞表达及与肌炎活动性的关系。结果:PM组肌内膜炎症细胞浸润明显、炎症组织学评分较对照组显著增高(3.0 ± 0.9 vs 0.2±0.4;p<0.01)。PM组巨噬细胞占浸润炎症细胞百分比较对照组显著升高(8.8±3.5vs0.5±0.7;p<0.01)。PM 组 NLRP3 炎性小体、caspase-1 及 IL-1β 阳性细胞百分比较对照组增高(17.2±9.5vs1.2±1.3;p<0.01)、(15.2±8.4vs0.3±0.5;p<0.01)及(14.5±6.2vs0.2±0.4;p<0.01)。相关性分析提示PM组肌肉内NLRP3炎性小体、caspase-1及IL-1β表达和炎症组织学评分呈正相关(r=0.588,p<0.05)、(r=0.546,p<0.01)及(r=0.559,p<0.01);上述三者和CD68+巨噬细胞浸润程度也呈正相关(r=0.672,p<0.01)、(r=0.409,p<0.05)及(r=0.443,p<0.05);NLRP3炎性小体、caspase-1及IL-1β表达和肌炎活动度评分(Global VAS)亦分别相关(r=0.627,p<0.01)、(r=0.407,p<0.05)及(r=0.435,p<0.05)。结论:NLRP3炎性小体/caspase-1/IL-1β信号轴和PM炎症活动相关;可能作为疾病活动性的指标。第二部分多发性肌炎大鼠模型NLRP3炎性小体/caspase-1/IL-1β信号轴的研究研究目的:通过分析多发性肌炎大鼠模型肌肉组织炎症及NLRP3炎性小体、caspase-1和IL-1β的表达,及抑制NLRP3炎性小体活性后肌肉炎症及caspase-1、IL-1β表达水平的变化,研究该信号轴在多发性肌炎大鼠模型发病中的作用。研究方法:通过家兔肌匀浆诱导多发性肌炎大鼠模型,设立3组:模型组(每次给予皮下注射肌匀浆10mg/kg,共免疫5次),模型+格列本脲组(肌匀浆免疫同时给予口服格列本脲5mg/kg/d),阴性对照(生理盐水皮下注射)。观察三组大鼠肌肉组织学炎症组织学评分,评价PM模型是否诱导成功;用免疫荧光双标技术检测巨噬细胞CD 68和NLRP3炎性小体表达之间的关系;qRT-PCR分析模型组、模型+格列本脲组和对照组NLRP3 mRNA转录水平差异。Western Blot技术检测三组中NLRP3、caspase-1、IL-1β的蛋白表达差异。明确NLRP3炎性小体在诱导PM大鼠模型中的作用及对caspase-1和IL-1β的调控。结果:模型大鼠组(n=5)受累肌肉肌纤维不同程度变性、坏死、核内移、大量炎性细胞浸润,炎症组织学评分均大于1分,提示5只PM大鼠模型均诱导成功。对照组(n=5)肌纤维大小形态一致、无核内移、基本无炎性细胞浸润,两组炎症等级评分有差异(2.6±1.3vs0.2±0.8,p<0.01)。免疫荧光双染可见模型组巨噬细胞CD68和NLRP3炎性小体共表达。qRT-PCR显示模型组肌肉组织NLRP3 mRNA转录水平较对照组升高(p<0.05),Western Blot显示模型组较对照组NLRP3蛋白表达显著增高(p<0.01)。给予NLRP3炎性小体抑制剂格列本脲后发现,模型+格列本脲组(n=5)可见少量炎性细胞浸润,肌纤维坏死不明显,炎症等级评分(1.3±0.6)较模型组(2.6±1.3)降低(p<0.05),较对照组(0.2±0.8)升高(p<0.05)。qRT-PCR显示模型+格列本脲组大鼠NLRP3 mRNA水平较模型组明显下调(p<0.05),和对照组之间无统计学差异(p>0.05)。Western Blot分析提示模型+格列本脲组大鼠肌肉中NLRP3和caspase-1的蛋白水平的表达均明显低于模型组(p<0.01),IL-1β表达较模型组减低(p<0.05),模型组+格列本脲组和对照组之间各蛋白表达均无统计学差异(p>0.05)。结论:巨噬细胞内NLRP3炎性小体活化能促进PM大鼠模型肌肉炎症;和caspase-1和IL-1β表达有关。第三部分Raw264.7巨噬细胞NLRP3炎性小体/caspase-1/IL-1β信号轴活化促进C2C12成肌细胞MHC-1表达上调研究目的:通过Transwell小室体外共培养Raw264.7巨噬细胞和C2C12成肌细胞,探讨LPS/ATP诱导的Raw264.7巨噬细胞NLRP3炎性小体/caspase-1/IL-1β信号轴活化对促进C2C12成肌细胞MHC-1表达的作用。研究方法:不同浓度及时间LPS/ATP刺激体外培养的Raw264.7巨噬细胞,用酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent,ELISA)、qRT-PCR、Western Blot 等多种分子生物学技术检测NLRP3炎性小体转录和表达、caspase-1活性体转化和IL-1β的分泌。采用Transwell小室共培养Raw264.7巨噬细胞及C2C12成肌细胞,用LPS/ATP 刺激 Raw264.7 巨噬细胞,qRT-PCR、Western Blot 检测 C2C12 成肌细胞炎性标记物MHC-1 mRNA转录和蛋白表达;用siRNA特异性干扰NLRP3后再予LPS/ATP刺激巨噬细胞,检测C2C12成肌细胞MHC-1的mRNA转录和蛋白表达。另外,用小鼠IL-1β细胞因子直接刺激C2C12成肌细胞,检测MHC-1的mRNA转录和蛋白表达水平是否升高,用siRNA特异性干扰IL-1β后再予LPS/ATP刺激巨噬细胞检测MHC-1是否有变化。最后检测NLRP3被特异性siRNA干扰后caspase-1活性体转化是否能被抑制。结果:1.用LPS和ATP刺激体外培养的Raw264.7巨噬细胞,发现不同浓度及时间LPS刺激后巨噬细胞NLRP3 mRNA转录水平和蛋白表达均较阴性对照组升高,在LPS浓度200ng/ml,作用时间24h时升高最明显(p<0.05)。共培养实验中用200ng/ml LPS和500μMATP刺激上室Raw264.7巨噬细胞,下室C2C12成肌细胞较阴性对照组MHC-1转录及表达上调(p<0.01),其作用在LPS刺激72h时最明显(p<0.01);用siRNA特异性干扰巨噬细胞NLRP3,再刺激巨噬细胞,C2C12成肌细胞MHC-1转录及表达较相应时间未干扰组明显下降(p<0.01)。2.予LPS和ATP刺激体外培养的巨噬细胞,检测上清液IL-1β分泌较阴性对照组升高(p<0.01);干扰NLRP3后给予巨噬细胞LPS和ATP刺激,上清液IL-1β分泌和对照组无差别(p>0.05)。3.用小鼠IL-1β细胞因子直接刺激C2C12成肌细胞,发现不同浓度和时间IL-1β刺激后的C2C12成肌细胞MHC-1的转录和表达较对照组升高,其中IL-1β浓度1ng/ml,刺激时间48h时升高最明显(p<0.01);用特异性siRNA干扰巨噬细胞IL-1β后,再用LPS及ATP刺激巨噬细胞,成肌细胞MHC-1表达较对照组上升不明显(p>0.05)。4.用LPS/ATP联合刺激Raw264.7巨噬细胞,检测Raw 264.7巨噬细胞发现pro-caspase1 向 caspase1 活性体(p10)转化较对照组增强(p<0.01);用 siRNA干扰NLRP3后再予LPS和ATP诱导Raw264.7巨噬细胞,caspase1活性体(p10)表达和对照组无差别(p>0.05)。结论:LPS/ATP体外诱导NLRP3炎性小体/caspase-1/IL-1β信号轴活化能促进C2C12成肌细胞特异性炎症标志物MHC-1表达上调。