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第1章 表达绿色荧光蛋白的“沪191”重组麻疹病毒的构建背景和目的:随着DNA重组技术和反向遗传学技术的发展,越来越多的RNA病毒通过基因工程编辑成为病毒载体。麻疹病毒（Measles virus,MV）属于副粘病毒科、麻疹病毒属,是单股、负链RNA病毒,多项动物实验和临床实验研究表明溶瘤MV能抑制多种类型的肿瘤生长。越来越多的研究开始关注提升溶瘤病毒治疗效果的方案和策略,其中运用溶瘤病毒作载体表达治疗基因具有良好的应用前景。“沪191”MV（MV-Hu191）减毒活病毒疫苗株在我国已有50多年的安全使用记录,本课题组在前期研究中已成功构建MV-Hu191的的反向遗传学系统,基于前期研究成果,在此部分研究中,我们将探索rMV-Hu191是否可高效表达外源基因,以期获得更为安全、高效的重组溶瘤MV。研究方法:应用无缝克隆分子技术将增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescentprotein,EGFP）基因序列的开放阅读框（open reading frame,ORF）与MV-Hu191 基因组的结构蛋白 N 蛋白（nucleoprotein）、P 蛋白（phosphoprotein）、H蛋白（hemagglutinin protein）连接构建中间质粒;应用PCR技术扩增MV-Hu191基因组各片段、中间质粒含目的基因和结构蛋白的片段以及各表达元件片段;使用限制性内切酶酶切和T4 DNA酶连接等方法将上述各片段对应相连,构建三种表达 EGFP 的“沪 191”重组 MV 毒株（recombinant MV-Hu191,rMV-Hu191）全长质粒;应用MV-Hu191的反向遗传学系统系统拯救三种表达EGFP的“沪191”重组MV毒株rMVs-Hu 191-EGFP;通过RT-PCR、DNA电泳、测序和观察荧光等方法验证外源基因表达;通过噬斑实验检测病毒复制能力,荧光显微镜和酶标仪检测EGFP的表达;病毒在Vero细胞上连续传代10代后,运用Sanger测序检测重组病毒基因组碱基是否发生突变。研究结果:1.成功构建表达EGFP的“沪191”重组MV的全长cDNA克隆。RT-PCR、DNA电泳及基因测序结果均显示EGFP的ORF已成功加入MV-Hu191基因组N蛋白5’端、P蛋白与M蛋白之间、H蛋白和L蛋白之间的非编码区。2.将三种表达EGFP的“沪191”重组MV毒株rMVs-Hu191-EGFP全长质粒克隆转染到工具细胞BHK-T7中,72小时后与Vero细胞共培养,共培养第24小时Vero细胞中出现特异性细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,在荧光显微镜下能观察到绿色荧光。3.表达EGFP的“沪191”重组MV毒株rMVs-Hu191-EGFP的复制特点与亲本毒株MV-Hu191相比有所变化。其中在N蛋白5’端非编码区表达EGFP的rMV-Hu191-N-EGFP毒株病毒滴度较低,显微镜下观察病毒特异性细胞病变最少;在P-M蛋白之间非编码区表达EGFP 的rMV-Hu 191-P-EGFP毒株病毒滴度达到峰值的时间尽管较亲本毒株延长了 36小时,但rMV-Hu191-P-EGFP的最高滴度却和亲本毒株相近;在H-N蛋白之间非编码区表达EGFP的重组病毒rMV-Hu191-H-EGFP的复制特点和亲本毒株rMV-Hu191十分相似,均在感染24-36小时间达到峰值。4.以 MOI=0.1 的表达 EGFP 的“沪 191”重 MV 毒株 rMVs-Hu191-EGFP 吸附6孔板中的Vero细胞,每隔12小时应用荧光显微镜观察荧光表达。rMV-Hu191-N-EGFP 毒株和 rMV-Hu191-P-EGFP 荧光表达量高于rMV-Hu191-H-EGFP毒株。以MOI=0.1的重组病毒株吸附96孔板中的Vero细胞,每隔12小时应用酶标仪检测荧光强度,所得结果与用荧光显微镜观察结果一致。5.将表达EGFP的“沪191”重MV毒株rMVs-Hu191-EGFP在Vero细胞上传代10次后通过观察荧光、测序验证无碱基突变。结论:1.应用DNA重组技术和反向遗传学系统成功构建不同位点表达EGFP的“沪191”重组MV毒株。2.不同位点表达EGFP的“沪191”重组MV毒株生长复制特点较亲本毒株rMV-Hu191相比发生变化,且前者外源基因表达量各不相同。3.在P蛋白和M蛋白之间非编码区表达EGFP的“沪191”重组MV毒株rMV-Hu 191-P-EGFP复制能力较亲本毒株相比并未削弱,且其外源EGFP表达量较各重组毒株相比最高第2章 表达绿色荧光蛋白的“沪191”重组麻疹病毒对非小细胞肺癌的溶瘤作用和机制研究背景与目的:非小细胞肺癌是成人最常见恶性肿瘤之一,且死亡率居高不下,尽管此癌症在儿童人群中极少见,但确诊腺癌的儿童预后极差,故研究有效的治疗方案仍是未来医学和生命科学研究的重点。溶瘤麻疹病毒（Measles virus,MV）作为一种新兴的肿瘤治疗方式,通过直接溶瘤和联合机体免疫反应可对多种肿瘤细胞产生显著的抗肿瘤效应。当肿瘤细胞表面CD46和Nectin-4受体表达增加,MV可通过CD46和Nectin-4受体进入肿瘤细胞发挥溶瘤作用。在国外,已有MV应用于非小细胞肺癌溶瘤治疗的研究报道,其应用的MV毒株主要是在美国和欧洲广泛使用减毒活病毒疫苗株Edmonston株及其衍生株。而在我国,广泛用于预防MV的减毒活病毒疫苗株是沪191株。目前关于沪191株用于溶瘤研究的报道极少。在第一部分研究中,我们发现在P蛋白（phosphoprotein）和M蛋白（membrane protein）之间非编码区表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,EGFP）的重组MV（recombinant MV-Hu 191,rMV-Hu 191）毒株 rMV-Hu 191-P-EGFP 能在 Vero 细胞中高效表达外源EGFP基因,且传代10次后未发生碱基突变,弥补了减毒活病毒疫苗株传代过程中碱基回复突变的缺陷。故本研究中,我们首次将表达EGFP的“沪191”重组溶瘤MV毒株rMV-Hu191-P-EGFP应用于非小细胞肺癌的溶瘤研究,试图通过自发性绿色荧光标记,无创性观察病毒在肿瘤细胞内的复制和分布,我们还将探索沪191”重组溶瘤MV毒株rMV-Hu191-P-EGFP对非小细胞肺癌的溶瘤作用及机制。研究方法流式细胞术检测非小细胞肺癌细胞（H460为大细胞肺癌细胞,H1975为腺癌细胞）表面CD46和Nectin-4表达水平;荧光显微镜观察表达EGFP的rMVs-Hu191-EGFP对非小细胞肺癌细胞（H460为大细胞肺癌细胞,H1975为腺癌细胞）的侵染效果;使用CCK-8试剂盒检测rMV-Hu191-P-EGFP对非小细胞肺癌细胞株H460和H1975 的溶瘤效果;使用结晶紫染色方法直观地观察rMV-Hu191-P-EGFP对非小细胞肺癌细胞株H460和H1975的溶瘤效果;生长曲线观察病毒在肿瘤细胞中的复制情况;Annexin V-FITC凋亡试剂盒、TUNEL实验、Western blot实验用于检测细胞胞凋亡;细胞表面钙网蛋白（calreticulin,CRT）和热休克蛋白90的表达、ATP和高迁移组蛋白1（HMGB1）的释放用来评估免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）的发生;实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）方法检测促炎症细胞因子mRNA表达水平;荷瘤裸鼠模型用以评估rMV-Hu191-P-EGFP的体内抗肿瘤效果;荧光显微镜观察和冰冻组织切片观察rMVs-Hu191-P-EGFP在正常组织和肿瘤细织中的表达;RT-qPCR检测肿瘤组织中病毒的复制情况;蛋白免疫印迹实验检测肿瘤组织中凋亡蛋白的表达。研究结果1.流式细胞术确认非小细胞肺癌细胞株H460和H1975表面有CD46和Nectin-4受体表达。2.三株不同位点表达EGFP的“沪191”重组MV毒株rMVs-Hu191-EGFP以感染复数（multiple of infection）MOI=0.1侵染非小细胞肺癌细胞株H460和H1975,均能在荧光显微镜下观察到绿色荧光的表达,其中rMV-Hu191-P-EGFP在非小细胞肺癌细胞株H460和H1975中表达量最高,同Vero细胞结果一致。3.非小细胞肺癌细胞感染不同MOI的rMV-Hu191-P-EGFP,使用减毒活病毒疫苗株试剂盒检测24、48、72和96小时肿瘤细胞的存活率。结果发现rMV-Hu191-P-EGFP对H460和H1975均有溶瘤效果,且呈剂量和时间依赖性。以rMV-Hu191亲本毒株为对照,比较不同MOI条件下第144小时肿瘤细胞的存活率,结果显示rMV-Hu191-P-EGFP对H460细胞的溶瘤效果优于rMV-Hu191,而在H1975细胞中,这种差异并不明显。当MOI=0.1时rMV-Hu191-P-EGFP即可诱导H460和H1975产生显著细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,从而在结晶紫染色实验中出现明显空斑。4.以MOI=0.1的rMV-Hu191-P-EGFP感染非小细胞肺癌细胞株H460和H1975,于感染后24、48、72和96小时检测rMV-Hu191-P-EGFP在肿瘤细胞中的复制滴度。rMV-Hu 191-P-EGFP复制滴度达到峰值的时间与亲本毒株相比延迟了 36小时,但病毒滴度能长时间维持在高值,且其复制滴度峰值并不低于亲本毒株rMV-Hu191。5.以 rMV-Hu191 为对照,当 MOI=0.5 时,rMV-Hu191-P-EGFP 和 rMV-Hu191均能诱导非小细胞肺癌细胞株H460和H1975发生细胞凋亡,其中H460细胞凋亡率分别为89.8和80.6,H1975细胞凋亡率分别为36.33和41.39。再分别设置高剂量组（MOI=1）和低剂量组（MOI=0.1）的rMV-Hu191-P-EGFP感染非小细胞肺癌细胞株H460和H1975,72小时后,收集细胞使用流式凋亡试剂盒检测凋亡细胞比例。当病毒稀释液MOI=0.1、0.5和1时,72小时后肿瘤细胞H460凋亡率分别为17.9%、36.6%和38.1%,肿瘤细胞H1975凋亡率分别为16.3%、31.3%和34.9%。蛋白免疫印迹实验结果显示凋亡蛋白Caspase 3和PARP的活化形式表达增加,且呈剂量依赖性。rMV-Hu191-P-EGFP诱导肿瘤细胞发生依赖Caspase 3途径的细胞凋亡。TUNEL荧光法检测晚期凋亡细胞碎片化DNA,TUNEL荧光法检测结果显示红色荧光强度随着MOI增加而增加。6.非小细胞肺癌细胞株H460和H1975吸附rMV-Hu191-P-EGFP后检测损伤相关模式分子（damage associated molecular patterns,DAMPs）的表达。rMV-Hu191-P-EGFP和rMV-Hu191（作为对照）侵染非小细胞肺癌细胞株H460和H1975后,第48小时收集细胞,用流式细胞仪检测到细胞表面CRT表达增加;设置不同MOI组别,检测到rMV-Hu191-P-EGFP诱导CRT表达水平呈剂量依赖型。ATP检测试剂盒和HMGB1 ELISA试剂盒分别检测到感染rMV-Hu191-P-EGFP后肿瘤细胞上清液中ATP和HMGB1水平分别于48小时和36小时升高。同时,免疫荧光法也检测到感染rMV-Hu191-P-EGFP后肿瘤细胞表面热休克蛋白90（heat shock protein,HSP90）表达增加。这些结果均表明感染rMV-Hu191-P-EGFP的非小细胞肺癌细胞株H460和H1975发生ICD。7.以MOI=0.5的rMV-Hu191-P-EGFP（rMV-Hu191作为对照）吸附非小细胞肺癌细胞株H460和H1975后,当所有肿瘤细胞都产生CPE时,收集肿瘤细胞总RNA,使用RT-qPCR方法检测促炎症细胞因子mRNA水平,结果显示rMV-Hu191-P-EGFP和rMV-Hu191均能诱导非小细胞肺癌细胞株H460 和 H1975 中白介素（interleukin-1β,IL-1β）)、干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白介素-6（interleukin-6,IL-6）,等促炎症细胞因子mRNA表达水平升高。8.为了评估rMV-Hu191-P-EGFP在裸鼠体内实验中的溶瘤效果,将5×106个H460细胞接种到裸鼠右侧腋窝。结果表明rMV-Hu 191-P-EGFP处理组和rMV-Hu191-P-EGFP感染肿瘤细胞上清液处理组在瘤内注射3天后,肿瘤体积增长速度较对照组均减慢,随着时间的增加,rMV-Hu191-P-EGFP和rMV-Hu 191-P-EGFP感染肿瘤细胞上清液对肿瘤生长的抑制效果逐渐增加,到瘤内注射第8天即荷瘤后第15天差异最明显,此时对照组出现裸鼠肿瘤长径大于 15mm3,说明 rMV-Hu 191-P-EGFP 和 rMV-Hu 191-P-EGFP诱导肿瘤细胞释放到上清液中的免疫原性物质对肿瘤生长均由抑制作用。rMV-Hu191-P-EGFP能明显延长荷瘤裸鼠生存时间,其中位生存期（26天）是对照组中位生存期（18天）的1.4倍。9.rMV-Hu 191-P-EGFP治疗组肿瘤组织的冰冻切片能在荧光显微镜观察到绿色荧光表达,提取的蛋白中可检测到活化Caspase 3凋亡蛋白和rMV-Hu191-P-EGFP的结构蛋白N蛋白表达。荧光显微镜观察和RT-qPCR检测结果未发现裸鼠正常组织（肺、脾和脑）中有病毒表达和复制。结论:1.非小细胞肺癌细胞株H460和H1975细胞表面表达CD46和Nectin-4。2.不同位点表达EGFP的“沪191”重组MV毒株rMVs-Hu191-EGFP能侵染非小细胞肺癌细胞株H460和H1975,并在肿瘤细胞中复制和表达EGFP。3.rMV-Hu191-P-EGFP对非小细胞肺癌细胞株H460和H1975的溶瘤效果呈时间和剂量依赖性。4.rMV-Hu 191-P-EGFP能诱导非小细胞肺癌细胞系H460、H1975发生Caspase 3途径的细胞凋亡、ICD以及促炎症细胞因子表达增加。5.rMV-Hu 191-P-EGFP和rMV-Hu 191-P-EGFP诱导肿瘤细胞释放的免疫原性物质均能抑制裸鼠肿瘤体积的增长。6.rMV-Hu191-P-EGFP治疗能明显延长小鼠生存时间,治疗组中位生存期（26天）是对照组中位生存期（17天）的1.4倍。7.rMV-Hu191-P-EGFP能在裸鼠肿瘤组织内表达EGFP,且也能诱导依赖Capase 3途径的细胞凋亡。在裸鼠正常组织中未见病毒表达和复制。