由外伤、肿瘤、感染等疾病因素造成的骨缺损在临床工作者日益多见,严重影响患者的身心健康和生活质量。目前临床首选的治疗方案仍是自体骨或异体骨移植,但存在来源有限,供体损伤,免疫排斥等问题,因此近年来国内外成骨研究的热点逐步转变成了基因治疗及组织工程骨的研究。生理状态下骨缺损修复成骨量不足的主要原因之一是,随时间的推移诱导成骨的细胞因子缺乏。将外源性蛋白生长因子直接补给于骨缺损处,都存在半衰期短、易被体液稀释、剂量不易控制、代价较高等缺陷,因而限制了其应用,基因治疗为此提供了一种新的有效的解决办法。骨缺损的基因治疗时如何使各种介入的生长因子能够适量、适吋、稳定的表达和释放,是基因治疗研究中的难点,这涉及选择合适的基因载体。目前的文献报道中,运用病毒或脂质体作为基因治疗的载体,其主要的优势在于转染率较高。不过病毒类载体也存在着免疫原性、潜在致病性等缺陷问题;而非病毒基因载体中,常用的脂质体尽管可以获得较高转染率,但同时具有细胞毒性,且转染受血清抑制,因而不适宜用于体内治疗。实际上生理性成骨需要2-3月的时间,是以骨形成蛋白为主的多种细胞因子参与的复杂过程,目前实验研究报道的大多数基因载体(除部分可整合入宿主DNA的病毒载体外),其转染细胞后表达时效只能维持1-2周左右,不能满足生理性成骨时效要求(2-3月)。因此如何研发一种生物相容性好,具有基因缓释表达释放的基因载体是基因工程未来用于骨缺损临床工作所需要克服的技术难题。近年来,可注射式水凝胶在骨缺损中的应用研究,逐渐成为组织再生医学中的研究热点。主要优点是可通过微创注射方式使用,损伤小,操作简单,水凝胶对不规则的组织的充填更加精确。目前报道的水凝胶主要作为支架材料用于骨缺损的修复,而作为基因载体的水凝胶报道较少,如果将基因载体也制备成水凝胶形式,既可单独使用,亦或和水凝胶型的支架材料混合使用,发挥可注射治疗的优势,更加符合整形外科微创治疗的原则,在日后的临床治疗中有很广阔的应用前景。针对上述问题,我们选择非病毒载体壳聚糖作为研究对象,希望构建出可注射的,缓释基因载体以满足骨缺损修复的要求。壳聚糖作为非病毒载体中的阳离子多糖,具有天然可降解的生物活性,使其治疗安全性得到有效保障。作为基因载体的主要缺点是转染效率不高,但由于其含有活性基团氨基,利用分子链的官能团改性、配体修饰等方法,可以合成多种具有不同性能的壳聚糖衍生物,充分扩展了壳聚糖的应用范围。课题组的前期试验已证实通过对壳聚糖的烷基化巯基化改性可合成巯基烷基化壳聚糖(TACS),其转染效率较普通壳聚糖有明显的提升,在此基础上,为适应骨缺损治疗需要,增强其基因缓释表达的效果,我们在构建的TACS/pDNA复合粒子的外层包裹枝节聚乙二醇(PEG)的羟丁基壳聚糖(HBC),形成新型基因载体TACS@EG-HBC/pDNA复合粒子。羟丁基壳聚糖,独特的温敏特性使其可在37℃下变成凝胶状态,这为复合粒子作为可注射剂型使用奠定理论的基础。枝节PEG的目的是增加整个材料的水溶性、稳定性,进一步提高转染的效率。由于包裹了EH-HBC的外层结构,理论上TACS@EG-HBC/pDNA复合粒子在转染细胞后的降解、基因的表达及维持效果更长,更符合骨缺损修复基因治疗的缓释要求。为验证以上假设我们选择融合标记基因绿色荧光蛋白(EGFP)的骨形成蛋白BMP4质粒(pBMP4-EGFP),分别构建TACS/pBMP4-EGFP及TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子。检测两种复合粒子对体外培养的兔骨髓间充质干细胞(BMSC)转染效果、成骨性能的影响,在小鼠肌肉内的缓释表达以及作为可注射式水凝胶对兔桡骨缺损的修复效果,为临床骨缺损治疗提供一种新的思路。实验一可注射壳聚糖缓释基因载体的构建、表征及温敏性能的鉴定目的:完成对壳聚糖的改性,合成巯基烷基化壳聚糖(TACS)以及枝节聚乙二醇的羟丁基壳聚糖(EG-HBC),利用TACS负载基因质粒,外包裹EG-HBC构建一种新型的可注射的基因载缓释系统。对其完成表征及温敏凝胶性能的鉴定。方法:(1)通过改性壳聚糖化学合成TACS、EG-HBC,傅里叶红外光谱鉴定合成结果,测定EG-HBC对PH值及温度响应性,及随温度改变粘滞度的变化,鉴定其温敏凝胶特性。(2)融合EGFP标记基因的质粒pBMP4-EGFP与TACS以复凝方式相结合形成TACS/pBMP4-EGFP,再通过EG-HBC物理沉降于其外层,合成TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP。利用动态光散射仪器、透射电镜对两种纳米复合粒子进行表征,凝胶电泳检测两种纳米复合粒子对基因质粒的携载以及保护作用。结果:(1)傅里叶红外光谱提示与CS相比,TACS存在(-CH3)基团,HBC存在(-OH)基团,EG-HBC里存在-CH2基团及酰胺键,证实TACS、HBC及EG-HBC的合成是成功的。(2)EG-HBC溶液在PH值从6.0升至6.5及7.0时,溶液也明显由清澈变浑浊絮状析出状,温度从25℃升到37℃时溶液呈凝胶状态。溶液粘度随温度改变从125.6 mPa·s(20℃)可升至157.5 mPa·s(50℃)。(3)取N/P比20的情况下制备的TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子多呈球形,粒径为192.6±16.11nm。TACS/pBMP4-EGFP复合粒子表面zeta电势为24.79±1.3mv,而TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子的zeta电势为-21.65±1.1mv。凝胶电泳实验证明TACS/pBMP4-EGFP与TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP两种复合粒子,均可保护质粒不被DNA酶降解,通过肝素的解离实验证明,经TACS/pBMP4-EGFP释放出的质粒维持原来的稳定性。体外缓释实验证明TACS/pBMP4-EGFP复合粒子5天释放量达80%,而TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子30天的释放量为37.8%,证实TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子基因质粒缓释效果更好,而在溶菌酶存在时,两种复合粒子均在3天内释放基因质粒80%,说明改性壳聚糖仍可被溶菌酶降解,生物安全性好。结论:本章节实验对壳聚糖的改性是成功的,成功制备TACS和EG-HBC。EG-HBC显示了良好的温敏和PH值响应性,在37℃时可出现凝胶化变性。最终合成的基因载体TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子,与TACS/pBMP4-EGFP复合粒子都显示出对基因载体较好的保护作用和粒子稳定性。但对携载基因的体外缓释效果,TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子缓释效果更明显。实验二可注射壳聚糖缓释载体介导BMP4-EGPF基因转染兔BMSC基因缓释,成骨性能影响及体内缓释的实验研究目的:探讨TACS/pBMP4-EGFP以及TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP两种复合粒子,作为缓释基因载体,转染兔BMSC的转染效率,基因缓释表达效果,及对其成骨诱导分化的影响。以小鼠骨骼肌内注射进行体内转染,探讨注射后两种基因载体复合粒子体内缓释表达效果。方法:(1)体外培养兔BMSC,流式细胞仪检测及成骨、成脂诱导,鉴定其干细胞特性。(2)采用两种基因载体复合粒子TACS/pBMP4-EGFP以及TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP转染兔BMSC,以脂质体2000做阳性对照,流式细胞仪及荧光显微镜下测试其EGFP基因转染效率与缓释表达的情况。免疫印迹实验(Weston Blot)及酶联免疫吸附测定(ELISA)比较TACS组和TACS@EG-HBC组BMP4的缓释表达情况。(3)未转染组作对照,碱性磷酸酶染色及活性测定、茜素红染色,比较采用两种复合粒子转染后的BMSC经体外成骨诱导,成骨性能的影响。(4)通过激光共聚焦显微镜观察TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP注射于小鼠骨骼肌内,基因缓释表达效果。结果:(1)通过梯度离心法提取培养的兔BMSC,长梭形,呈旋涡状生长,5-7天传代一次。P3代兔BMSC阳性表达CD44(96.6%)、CD90(98.9%),阴性表达CD45(0.21%)、CD34(0.06%),成脂诱导油红染色可见红色脂滴,成骨诱导后可见Vocanssa染色的黑褐色结节。(2)体外细胞转染实验,经流式细胞仪测定,TACS/pBMP4-EGFP对BMSC转染率在转染后3天、7天、14天分别是24.8±5.1%、31.1±3.3%和34.5±4.6%,TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP对应时间的转染率分别是5.9±2.4%、17.5±3.9%和35.3±4.2%。荧光显微镜下观察结果基本与其一致。Weston Blot及ELISA实验测试两种复合粒子转染后的BMSC均可表达BMP4,而TACS@EG-HBC组的缓释表达作用更强。(3)对成骨诱导的影响以未转染组细胞为对照,三组细胞经成骨诱导后,14天时TACS@EG-HBC组较TACS组及未转染组的ALP磷酸酶活性更强,21天茜素红染色的钙结节更加明显。(4)激光共聚焦显微镜可观察到TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP注射于小鼠骨骼肌内,基因缓释表达效果可维持12周。结论:两种基因载体复合粒子均可转染BMSC使其缓释表达EGFP和BMP4,与TACS/pBMP4-EGFP复合粒子相比,TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP显示出更好的基因缓释表达效果,转染后的BMSC具有更好成骨诱导能力。小鼠的肌肉内注射可证实TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP在体内基因缓释表达可持续到12周。实验三携载BMP4-EGFP的可注射型壳聚糖缓释基因复合粒子对骨缺损修复的实验研究目的:进一步探讨携载pBMP4-EGFP基因的两种改性壳聚糖复合粒子,修复兔桡骨缺损时的体内成骨效果,及质粒在骨缺损处缓释表达情况。方法:将24只新西兰白兔分随机分三组,均构建双前肢18mm完全性骨缺损模型,于模型建立后7天,予骨缺损局部分别注射含80ug质粒pBMP4-EGFP的TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子混悬液或TACS/pBMP4-EGFP复合粒子混悬液,空白对照组不做任何处理。术后2、4、8、12周处死实验动物,行缺损处大体标本,X摄片,Lane-SandhuX线评分以及新生骨组织HE染色了解骨缺损修复情况。12周对已对合修复缺损的骨组织行生物力学测试评价其承重能力。新生骨组织BMP4免疫组化了解基因在体内的转染缓释表达情况。结果:所有试验动物均存活良好,大体组织学检查,空白组自4周开始有少量新骨生长,至第12周仍存在较大缺损,新骨生成缓慢。TACS组和TACS@EG-HBC组从2周即可观察到骨缺损断端出现不规则骨痂,后期随时间推移,TASC@EG-HBC组的新骨生成较TACS组快,至12周时TACS@EG-HBC组4个标本,桡骨基本对接修复完全,但生物力学检测,较正常桡骨强度弱,差异有统计学意义(n=4 P<0.05)。X线摄片修复效果评价与大体标本一致。Lane-SandhuX线评分,显示4,8,12周不同组别间的分值比较具有统计学差别,TACS@EG-HBC组在8,12周两个时间点分值均高于其他两组,且差别具有统计学意义(P<0.05 n=4)。新骨生成处HE染色12周时,空白对照组有骨小梁结构但骨皮质结构不明显。TACS组板层骨不成熟。TACS@EG-HBC组骨小梁连接成片,可见大量板层骨形成,骨质致密,皮髓质界限清晰。免疫组化提示在12周时TACS@EG-HBC组新生骨组织内仍可观察到零散部分的少量BMP4阳性细胞,因此较TACS组缓释表达作用更强。结论:前期构建的TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP在骨缺损治疗中,发挥了较好基因缓释载体的功能,增强了新骨生成的效果。经局部注射后,以12周为观察节点时,局部转染含80ug质粒的TACS@EG-HBC/p BMP4-EGFP复合粒子,可使骨缺损局部完成对合生长。