帕金森病是一种神经系统退行性疾病,目前该病已成为老年致残和病死的主要疾病之一,它的主要病理变化是投射至纹状体的黑质致密部多巴胺神经元和轴突丢失。黑质内多巴胺神经元的减少,使纹状体内多巴胺含量降低,引起中枢多巴胺和乙酰胆碱比例失调,在临床上出现震颤、肌肉僵直、运动弛缓等一系列症状。随着研究的深入,已发现 PD 中中脑黑质多巴胺神经元丢失的主要方式之一是细胞凋亡,但由于 PD 病因及病机的复杂性,至今尚无理想的治疗方法,中医药用于防治帕金森病已取得了可喜的苗头,本实验根据中医理论和临床实践,组成了银杏平颤方, 从细胞凋亡的诱因、调控分子等多个方面研究并比较了银杏平颤方及拆方对 MPTP 诱导 PD 鼠的防治作用,揭示了中药的作用和机制。 本实验分为四个部分:(1)观察 PD 鼠中脑黑质致密部多巴胺神经元的丢失和凋亡以及银杏平颤全方和拆方的作用;(2)观察 PD 鼠脑内线粒体酶复合体的活性变化以及银杏平颤全方和拆方的影响;(3)应用免疫组化技术观察 PD 鼠脑内不同部位钙结合蛋白 Calbindin D28k 的表达和中药的影响;(4)应用免疫组化和原位杂交技术观察 PD 鼠黑质致密部凋亡的主要调控分子 Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Caspase-3mRNA 和Bcl-2mRNA 的表达以及中药的作用。 实验选用 C57BL/6J 小鼠,应用 0.3%MPTP(生理盐水配制)按 30mg/kg/天腹腔注射,连续 5 天,复制 PD 模型。动物随机分为六组:(1)正常对照组(NC);(2)模型对照组(MC);(3)银杏平颤全方治疗组(简称全方组, GBPR);(4)中药清热解毒方治疗组(简称解毒组, JDR); (5) 中药平肝熄风方治疗组(简称平肝组, PGR);(6)中药化瘀通络方治疗组(简称化瘀组, HYR)。动物的存活期分别是 14 天和 28 天。 主要实验结果如下: 1. 中药银杏平颤全方和拆方可抑制 PD 鼠中脑黑质致密部 TH 阳性神经元的丢失和 凋亡 实验研究表明:造模后 PD 鼠中脑黑质致密部酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的数目比正常组明显减少,14 天,减少了 52.14%,28 天,减少了 60.78%;黑质致密部 TH阳性神和纤维的光密度也明显降低,两个时间段分别降低了 90.42%和 93.20%。14 天,各中药治疗组可部分减少黑质致密部 TH 阳性神经元的丢失,其丢失程度较模型组明显减低,其中解毒组和化瘀组分别减少了16.60%和17.55%,效果较好;全方组和平肝组分别减少了 22.72%和 20.61%。28 天,全方组 TH 阳性神经元的数量减少的程度最低,其丢失率为 33.2%, 其它三个拆方组减少的程度较大,解毒组为 49.23%、平肝组为 44.9%和化瘀组为43.94%; 中药各组也可不同程度的增加PD鼠黑质致密部TH阳性神经元和纤维的光密度。 造模后,Tunel 方法显示 PD 鼠中脑黑质致密部凋亡细胞的数量明显增多,阳性细胞<WP=4>2 银杏平颤方对 PD 鼠中脑多巴胺神经元凋亡的影响及机制探讨核的着色强度也明显增加,14 天更明显;各中药治疗组可抑制该部位细胞的凋亡,14天,解毒组效果最好,28 天,全方组和平肝组效果较显著。 2. 中药银杏平颤全方和拆方可调节 PD 鼠脑内线粒体酶复合体的活性 通过常规比色法和测氧法检测了不同组别动物脑内线粒体酶复合体 I、II 和 IV 的活性,结果表明MPTP可导致 PD 鼠脑内线粒体(包括中脑黑质)酶复合体 I、IV 的活性下降,对酶复合体 II 的活性无明显影响。银杏平颤全方中药在早期可以部分拮抗 MPTP引起的线粒体酶复合体 I、IV 的活性下降;拆方各组中药中,解毒中药在早期(14 天)一般都能抑制线粒体酶复合体活性的下降,甚至提高线粒体酶复合体Ⅱ的活性,但在后期(28 天)无此作用;而平肝中药在早期抑制 MPTP 引起的线粒体酶复合体活性的下降的效果不明显,后期效果显著;化瘀中药则在两个时段均能抑制 MPTP 引起的线粒体酶复合体Ⅳ活性的下降,提高线粒体酶复合体Ⅱ的活性,但对线粒体酶复合体 I 的下降在后期无明显抑制作用。提示银杏平颤全方及其拆方中药可能通过部分阻止线粒体酶复合体活性的下降,保护线粒体的功能,防止多巴胺神经元的凋亡。 3. 中药银杏平颤全方和拆方可调节 PD 鼠脑内 Calbindin D28k 的表达 Calbindin D28k(CB)是脑内神经元内存在着一个重要的钙结合蛋白,它可以通过结合细胞内的钙离子,调节细胞内的钙平衡,对神经元损伤起到部分保护作用。我们的实验显示 PD 鼠脑内多巴胺神经元丢失的敏感区内(黑质和 VTA)Calbindin D28k 的表达可反射性的增高,在海马 CA1 区和 CA2 区 Calbindin D28k 的表达也升高,而在脑皮质Calbindin D28k 的表达降低。提示不同脑区神经元对 MPTP 的毒性反应不同,神经元内Calbindin D28k 的表达增高,可能是细胞内钙超载导致神经元启动自我保护机制的结果。一般来说,全方和化瘀中药可上调中脑、皮质和海马 CB 表达,早期(14 天)较后期(28 天)更明显,提示中药可能通过增加钙结合蛋白 CB 的表达,调节细胞内的钙平衡,达到保护神经元的目的。另外我们同样观察到解毒组中药在早期上调 CB 的作用明显,后期效果不显著;而平肝中药在后期上调 CB 的效果明显,这提示在 PD 早期多巴胺神经元内各种自由基的产生加速、细胞