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本研究以4对极端高低乳蛋白率和乳脂率育种值的中国荷斯坦公牛为研究对象,利用Illumina重测序技术鉴定奶牛全基因组indel位点并获得乳成分高低组间差异indels;通过整合分析已报道奶牛产奶性状QTLs、GWAS鉴定的显著SNP位点及基因生物学功能,鉴定奶牛产奶性状候选功能基因和indel位点,进行遗传效应分析并鉴定关键indel位点及功能。试验1:全基因组indel位点的检测和奶牛产奶性状候选基因挖掘对8头具有极端高低乳蛋白率和乳脂率育种值的中国荷斯坦公牛的基因组DNA进行Illumina高通量重测序,共检测912,302个indel位点(1-49 bp),基于此共鉴定到高低组间等位基因方向一致的indels 3,625个,经常规测序验证其阳性率为70%。整合差异indel位点、产奶性状QTL数据库、已报道GWAS显著SNP位点以及基因的功能,共鉴定到29个与产奶性状相关的候选基因和 51个 indels,这 29 个基因为FCGR2B、CENPE、RETSAT、ACSBG2、NFKB2、TBC1D1、NLK、MAP3K1、SLC30A2、ANGPT1、UGDH、IL22RA1、SCD5、EEF2、SEC24D、SCARB1、SAA1、NR1D2、RICTOR、ELOVL6、ADAM17、GPAM、XAF1、SLCO1A2、CD1B、FA2H、ACADL、ERBB2相PARD6A。试验2:候选基因indels与产奶性状的遗传效应分析及功能验证选取40头中国荷斯坦公牛作为试验群体,对鉴定到的51个indels采用池DNA克隆测序的方法进行检测,结果显示共36个indels在该群体中存在多态;通过MALDI-TOF-MS分型技术对其中的24个indels在1093头中国荷斯坦牛群体中进行分型,并与5个产奶性状进行关联分析,结果这24个indels至少与1个产奶性状关联程度达到显著或者极显著水平(P<0.05或P<0.01)。针对遗传效应显著的4个indel位点,利用MatInspector软件和Enhancer Element Locator(EEL)软件预测转录因子结合位点和潜在增强子元件,并通过启动子和增强子活性分析、凝胶阻滞试验(EMSA)和超迁移凝胶阻滞试验(super-shift EMSA)进行功能验证,结果表明:ACSBG2基因5,调控区rs383700527位点在GCC碱基插入后检测到转录因子结合的改变,启动子活性分析和EMSA结果也验证上述预测,super-shift EMSA试验检测到ZNF350转录因子的结合;EEL软件预测SEC24D基因3’调控区ss2019489560位点所在区域为增强子序列,T碱基缺失前后通过结合不同的转录因子影响双荧光素酶报告基因的表达活性,EMSA和super-shift EMSA试验检测到MYBL2转录因子的结合。IL22RA1基因上游调控区位点ss2019489552和FCGR2B基因内含子区位点rs380213439发生前后启动子活性无显著变化。试验3:候选基因ACSBG2的功能验证针对ACSBG2基因的CDS序列设计siRNA,转染至MAC-T细胞系中进行RNA干扰试验,结果显示siRNA的干扰效率达60%,转染48h后检测乳脂相关基因的表达变化情况发现SCD、DB1、CD36、VLDLR和SREBF1相对表达量发生极显著或显著升高(P<0.01或P<0.05),ACOX1、CPT1B和INSIG1基因相对表达量呈极显著或显著水平降低(P<0.01或P<0.05)。通路分析结果推测ACSBG2基因的沉默抑制脂肪酸氧化,进而通过上调脂肪生成基因硬脂酰辅酶A脱氢酶(SCD)和B类清道夫受体(CD36)的表达来促进甘油三酯的合成,从而影响奶牛的乳脂性状。