小肠移植的难度众所周知。小肠富含淋巴组织的高度免疫源性器官,肠腔内含有大量微生物,由于这两个主要原因,小肠一度被视为器官移植的禁忌。但是随着近几十年外科技术的发展,小肠移植仍然获得了不少的成功。目前美国匹兹堡大学Starzl器官移植研究所的移植物10年存活率达61%,15年存活率达50%。围绕外科技术、免疫抑制方案、排斥反应的监测与治疗、感染防治等主要技术的研究,小肠移植在未来必定会有一番广阔的发展。这是因为目前小肠移植的需求仍然很大,诸多肠功能障碍的病人无法最终摆脱全肠外营养支持(total parenteral nutrition, TPN),甚至永远不能适应。在这种背景下,小肠移植是挽救生命最后的办法,其发展显得尤为重要。健康人体肠道菌群在维护正常的肠道微生态,调节宿主的免疫和影响包括器官发育及代谢在内的宿主发育及生理都起及其重要的作用,对正常健康人体的生长发育和免疫调节中起重要作用。肠道菌群一旦失调,在疾病时紊乱的有害细菌常会易位入血,加重病情。小肠移植由于其特殊性,肠道菌群势必在围手术期发生巨大改变,这种细菌改变有什么规律?临床如何早期发现并处理肠源性菌群紊乱?如何预防肠源性细菌易位?这些都是目前小肠移植研究的重点和难点。小肠移植术后存在肠道菌群失衡,肠黏膜屏障损伤,需要采用抗生素、微生态制剂(包括益生菌,益生元等)恢复正常菌群结构,保护肠黏膜屏障,减少细菌易位的发生。益生菌除了拮抗病原菌作用和营养作用,还提高机体的巨噬细胞、NK细胞功能,刺激S-IgA分泌。一些动物实验和临床研究报告显示：小肠移植后应用益生菌可以降低移植术后感染的发生率,应用益生菌防治移植术等多种疾病、手术后感染是目前前沿性研究课题。那么小肠移植急排期应用益生菌对菌群变化到底有何影响?如何通过益生菌的给予来预防肠源性细菌易位?这些都对预防和治疗小肠移植后感染的发生具有重大意义。本论文主要采用基于细菌DNA的PCR-DGGE技术研究大鼠小肠移植急排期肠道菌群和肠黏膜上皮屏障的变化规律,观察和研究原位移植术后急排期菌群的变化规律,以及围手术期应用抗生素和益生菌对肠道菌群的改变,为调控肠道微生态和移植后感染的防治提供新思路和新策略。本课题对此进行研究,共分两个部分：第一部分 小肠移植急排期肠道菌群和肠粘膜上皮的改变特征目的：小肠移植急排期肠道菌群改变是导致移植物遭受细菌易位的重要因素之一。本部分研究小肠移植急排期模型大鼠回肠肠道菌群及肠黏膜上皮变化特征。方法：实验动物随机分为3组：1)假手术组(A组,n=6)均采用BN大鼠,取正常BN大鼠只打开腹腔便缝合;2)同基因移植组(B1组,n=6)：供受体各6只,均采用BN大鼠,行节段性小肠原位移植术,同基因小肠移植(BN-BN);3)同种异基因移植组(B2组,n=6)：Lewis大鼠6只为供体,BN大鼠6只作为受体,行节段性小肠原位移植术,异基因小肠移植(Lewis-BN)。采用变形梯度凝胶电泳(DGGE)及条带分析研究移植后Day 7大鼠回肠菌群的变化特征。并检测移植后Day 7大鼠血清D-乳酸和血浆内毒素水平,采用透射电镜及普通病理检测肠黏膜形态学及紧密连接结构变化,应用免疫组化法研究紧密连接蛋白Claudin-1的变化。结果：移植后Day 7,各组回肠菌群DGGE分析显示,小肠移植急排期模型建立后同种异基因组大鼠回肠菌群发生显著改变。菌群变化特征为：大肠杆菌等有害菌明显增多,部分乳酸杆菌、毛螺菌等明显减少。损伤特征为：肠粘膜上皮较正常对照明显受损,小肠绒毛的完整性受到破坏,紧密连接的缝隙较正常对照组明显增宽。异基因组Day 7的肝功能损害相比具有显著差异,D-乳酸、血清内毒素水平明显增高。结论：大鼠节段性小肠移植模型建立以后,急排期术后Day 7小肠肠道菌群发生明显紊乱,肠粘膜屏障功能受损,最特征的是大肠杆菌增殖,乳酸杆菌、毛螺菌减少。第二部分 肠道菌群干预对小肠移植急排期肠道菌群和肠粘膜上皮的改变特征目的：抗生素和益生菌对小肠移植急排期肠道菌群和肠粘膜上皮的改变至今尚不清楚。本部分主要探讨庆大霉素和培菲康为代表的菌群干预对大鼠小肠移植急排期回肠肠道菌群及肠黏膜上皮的变化情况。方法：实验动物随机分为3组,每组连续灌胃14 days(术前7 d,术后7d)。1)对照组(C组,异基因+NS组,n=6)：供受体各6只,行节段性小肠原位移植术,异基因小肠移植(Lewis-BN)+2ml (14days)生理盐水灌胃；2)抗生素组(D组,异基因+Gen组,n=6)：供受体各6只,行节段性小肠原位移植术,异基因小肠移植(Lewis-BN)+2ml (14days)庆大霉素灌胃；3)益生菌组(E组,异基因+Bifid组,n=6)：供受体各6只,行节段性小肠原位移植术,异基因小肠移植(Lewis-BN)+2ml (14days)培菲康灌胃。采用变形梯度凝胶电泳(DGGE)及条带分析研究移植后Day 7大鼠回肠菌群的变化特征。并检测移植后Day 7大鼠血清D-乳酸和血浆内毒素水平,采用透射电镜及普通病理检测肠黏膜形态学及紧密连接结构变化,应用免疫组化法研究紧密连接蛋白Claudin-1的变化。结果：移植后Day 7对各组回肠菌群DGGE分析显示,抗生素组大鼠回肠菌群多样性明显减少,与对照组的菌群结构有显著差异,表现为2种乳酸杆菌的减少和大肠杆菌的增多。益生菌组回肠菌群多样性并未减少,大肠杆菌的繁殖明显弱于抗生素组。回肠肠粘膜上皮显示紧密连接蛋白Claudin-1在抗生素组损害较对照组严重,益生菌组的回肠粘膜上皮则明显修复,电镜显示回肠上皮的紧密连接间隙在抗生素组明显增宽,而益生菌组微绒毛的倒伏和损坏明显减少。Day 7的肝功能水平显示抗生素组损害严重,益生菌组与对照组相比未见显著差异；D-乳酸、血清内毒素水平益生菌组明显降低,与对照组和抗生素组均具有明显差异。结论：小肠移植围手术期使用抗生素和益生菌都会导致急排期回肠菌群的改变。抗生素加剧了菌群结构和数量的改变,表现为大肠杆菌的显著增多,肠粘膜屏障功能损害严重。而益生菌则有效减少了有害菌的繁殖,增加了乳杆菌等有益菌的数量,减少了肠粘膜屏障功能的损伤。全文结论大鼠小肠原位移植模型稳定建立后,回肠肠道菌群在急排期发生明显紊乱,表现为大肠杆菌等有害菌明显增多,乳酸杆菌等有益菌明显减少。肠粘膜上皮受损,肠粘膜屏障功能遭到破坏。本部分研究表明小肠移植会导致回肠肠道菌群的紊乱,同时小肠移植回肠粘膜上皮的紧密连接受损,二者共同导致小肠移植急排期肠源性细菌易位的发生。庆大霉素为代表的抗生素和培菲康为代表的益生菌菌群干预对小肠移植急排期菌群变化也有明显关系。抗生素组大鼠回肠菌群多样性明显减少,肠黏膜上皮的受损更为显著,两者共同导致肠源性细菌易位的发生：而益生菌能减少这些损伤,益生菌有效减少了有害菌的繁殖,增加了乳杆菌等有益菌的数量,肠粘膜上皮紧密连接蛋白和紧密连接间隙在益生菌组均有修复。综上,围手术期菌群干预对小肠移植急排期回肠菌群分布和肠粘膜屏障的变化有很大影响。