仿刺参是我国北部沿海地区最重要的经济养殖品种之一。温度是影响刺参生长繁育和生理活动重要的环境因子,随着全球气候的变化,极端性气候如夏季高温等也在全球许多区域更频繁地出现,近几年我国夏季持续的高温天气对山东、辽宁等地区池塘养殖刺参造成严重影响,大量刺参腐烂死亡,导致刺参养殖业遭受巨大的经济的损失。目前我国刺参养殖规模的日益发展对加强刺参生长生理活动的基础研究提出了需求,研究高温胁迫对刺参机体的影响和刺参的应答反应机制,为高温环境刺参养殖提出有效的应对策略,对水产养殖产业健康具有十分重要的意义。本研究中,以仿刺参作为研究对象,采用RNA-seq技术,分析在温度变化后仿刺参消化道组织的差异表达基因的表达规律,在此基础上探究仿刺参消化道组织高温胁迫的分子调控机理;使用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术,检测了仿刺参消化道的差异甲基化图谱,分析了仿刺参差异DNA甲基化应对温度胁迫的机制;并对转录组测序数据和全基因组重亚硫酸盐测序数据进行了联合分析,分析了DNA甲基化对仿刺参温度升高过程中差异表达基因的调控作用,主要研究内容和结果如下:1.为系统了解不同温度处理后仿刺参消化道转录组的特征,我们选取了不同温度条件下的2龄仿刺参,共构建了9个c DNA测序文库,经过测序得到平均每个样品产出52,307,882条原始数据(Raw reads),过滤后,约有7.68Gb大小的clean reads。利用RNA-seq技术获得了仿刺参消化道不同温度的转录组表达谱后,随机选取17个差异表达基因并利用荧光定量PCR验证了测序结果的可靠性。发现T26 vs T20、T32vs T20、T32 vs T26鉴定出来的差异表达基因的数量分别为59、3479和1635个。通过对DEGs的KEGG和GO富集分析,在T26 vs T20和T32vs T20两个比较组中,大多数差异基因都富集在代谢过程,很多与免疫和表观修饰相关的基因在T32vs T20组中都有显著的上调或下调表达,此外,在T32 vs T26组表达上调的差异基因显著富集于内质网的蛋白质加工通路上,而表达下调的差异基因主要富集于过氧化物酶体通路上。暗示着这些通路或基因可能参与仿刺参高温32℃下的响应机制。2.全基因组甲基化分析。构建了仿刺参不同温度下消化道组织全基因组DNA甲基化图谱。差异甲基化区域分析发现,在基因体区T26vs T20组差异甲基化基因2199个;T32vs T20组差异甲基化基因2254个;得到T32vs T26组差异甲基化2334个。在启动子区域T26组与T20组的差异甲基化基因有1015个;T32组与T20组的差异甲基化基因有1022个;得到T32组与T26组的差异甲基化基因有1106个。富集分析可知T32组比T20组,启动子区和基因体区的差异甲基化基因主要富集在代谢过程。T26vs T20组启动子区DNA差异甲基化基因主要富集在各种代谢过程包括碳代谢,T26vs T20组基因体区DNA甲基化差异基因主要富集在过氧化物酶体。此外,我们还发现内吞作用,泛素介导的蛋白降解途径以及内质网中蛋白质加工通路等通路在T32比T26组中低甲基化差异基因的KEGG通路中富集程度较高,而在T26vs T20组高甲基化差异基因也富集到这两个通路,推测这些基因可能与仿刺参在水温由26℃升高到32℃过程的DNA甲基化调控机制有关。3.对转录组测序数据与全基因组甲基化测序数据进行联合分析,发现在T26vs T20组的基因区重叠基因有3个;启动子区重叠基因有2个;T32vs T20组的基因区重叠基因有241个,启动子区重叠基因有82个;T32vs T26组的基因区重叠基因有108个,启动子区重叠基因有26个。对DNA甲基化与基因表达的交集基因进行富集分析,T26vs T20组富集到的基因很少,都与代谢有关,T32vs T26组基因体区显著富集到抗氧化有关的谷胱甘肽代谢;T32vs T20组基因体区,也显著富集到抗氧化相关的过氧化物酶体和视黄醇代谢。此外,还发现多个与抗氧化有关的基因在T32vs T20组的启动子区或基因体区均体现出基因甲基化水平与表达水平的负相关。这些数据表明高温32℃处理后可以显著影响参与抗氧化的基因,也说明仿刺参消化道中DNA甲基化修饰可能通过调控这些基因的甲基化状态参与高温适应分子机制。