研究背景:青光眼为全球首位不可逆性致盲眼病,是一组以进行性视神经损伤,视野缺损为重要特征的视神经疾病,病理性眼压升高为其重要的危险因素。目前,治疗青光眼唯一具有循证医学证据的方式是降低患者眼压,其中,外滤过手术是降眼压最为有效的手术方法之一,但术后瘢痕化仍是影响手术成功率的最重要因素。尽管丝裂霉素C（Mitomycin C,MMC）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）等抗代谢药物的临床应用能一定程度上提高手术成功率,然而其药物毒性作用常引起严重的并发症,并且即使在使用抗代谢药物情况下依然有部分患者预后不佳。因此,外滤过手术后的瘢痕化是始终困扰青光眼医生的一个亟待解决的问题。青光眼外滤过手术后的伤口愈合涉及到一系列复杂和动态的级联过程,包括止血期、炎症期、增殖期和组织重塑期,多种细胞因子和生长因子可参与到该过程中。其中,白细胞介素6（Interleukin 6,IL-6）作为一种重要的炎症介质,可在炎症期被大量释放;且以往已经有大量研究表明,IL-6能够诱导成纤维细胞活化为肌成纤维细胞参与纤维化的形成。转化生长因子β（Transforming growth factor,TGF-β）同样是一种重要的促纤维化因子,在伤口愈合的增殖期可刺激人Tenon囊成纤维细胞（Human Tenon’s capsule fibroblasts,HTFs）迁移、增殖、细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）合成和向肌成纤维细胞表型转化。信号转导及转录激活蛋白3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）是一种重要的核转录因子,可在多种细胞因子和生长因子的刺激下发生磷酸化而被激活,磷酸化的STAT3蛋白形成二聚体,随后进入核内与DNA结合,并最终调节靶基因的转录。在生理状态下,STAT3的信号转导受细胞因子信号转导抑制因子3（Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）的负反馈调控。据文献报道,STAT3在调节细胞生长、分化和存活方面发挥重要作用,并且能参与免疫应答和炎症等多种生物学过程。由于激活STAT3的许多细胞因子以及生长因子可诱导纤维化的发生,同时STAT3调节的众多生物学过程诸如细胞生长、分化、存活以及炎症等在瘢痕形成过程中发挥重要作用。因此,我们推测STAT3很可能是促纤维化作用的共同靶点。目前,尚没有关于STAT3在青光眼外滤过手术后瘢痕化中作用的相关研究。因此,本研究拟收集青光眼患者的结膜下组织,检测STAT3在人结膜下组织中的表达与激活情况,并提取和培养原代HTFs,分别利用TGF-β1和IL-6构建非炎症和炎症依赖途径诱导的体外HTFs纤维化模型,以探究STAT3在HTFs纤维化中的作用及机制。最后,构建SD大鼠青光眼外滤过手术模型,探究STAT3特异性抑制剂S3I-201对大鼠青光眼外滤过手术后结膜下组织瘢痕形成的影响。目的:探究STAT3在青光眼外滤过手术后瘢痕形成中的作用及其分子机制。方法:1.临床手术中收集青光眼患者的瘢痕化与非瘢痕化结膜下组织,其中,瘢痕化的结膜下组织来源于因滤过道瘢痕化眼压失控再次来我院手术的青光眼患者,非瘢痕化的结膜下组织来源于没有眼部手术史的青光眼患者。收集到的结膜下组织行冰冻切片以及免疫荧光染色检测P-STAT3和STAT3的表达情况。2.利用人结膜下组织提取HTFs,然后用TGF-β1和IL-6/s IL-6R体外诱导HTFs纤维化模型;通过Western Blot实验和细胞免疫荧光实验检测HTFs中PSTAT3和STAT3的表达情况。3.分别利用STAT3的特异性抑制剂S3I-201抑制STAT3激活以及STAT3si RNA敲低STAT3的基因表达水平;通过CCK-8实验检测细胞的增殖能力,细胞划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移能力,Western Blot和细胞免疫荧光实验检测细胞Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达情况,同时鬼笔环肽与α-SMA免疫荧光共染检测细胞应力纤维形成情况。4.利用TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导HTFs纤维化的同时在细胞培养基中加入S3I-201;通过CCK-8实验检测细胞的增殖能力,细胞划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移能力,Western Blot和细胞免疫荧光实验检测细胞Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达情况,同时鬼笔环肽与α-SMA免疫荧光共染检测细胞应力纤维形成情况。5.利用TGF-β1和IL-6/s IL-6R分别培养HTFs后通过Western Blot实验检测SOCS3的表达水平;然后利用慢病毒感染HTFs过表达SOCS3,在LV-NC和LVSOCS3的HTFs培养基中再次分别加入TGF-β1和IL-6/s IL-6R;通过CCK-8实验检测HTFs的增殖能力,细胞划痕实验和Transwell小室实验检测HTFs的迁移能力,Western Blot实验检测HTFs的P-STAT3、STAT3、Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达情况。6.选取成年雄性SD大鼠构建青光眼外滤过手术模型。实验分为空白对照组（Control）、载体对照组（Vehicle）、MMC结膜下敷贴组（MMC）和S3I-201结膜下注射组（S3I-201）。分别于术前、术后3、7、14、21、28天测量大鼠眼压以及术后3、7、14、21、28天显微镜下观察大鼠眼球滤过泡形态并拍照。术后28天时处死大鼠并取眼球行组织冰冻切片和石蜡切片。通过TUNEL凋亡染色评估药物毒性情况;HE和Masson染色观察滤过道周围结膜下组织的病理学变化和胶原沉积情况;免疫荧光染色检测滤过道周围结膜下组织内Collagen-Ⅰ和Fibronectin的表达情况。结果:1.组织切片免疫荧光染色结果显示,STAT3在人结膜下组织中呈阳性表达。与非瘢痕化的结膜下组织相比,瘢痕化的结膜下组织中P-STAT3表达水平升高。2.Western Blot实验和细胞免疫荧光实验结果显示,STAT3在HTFs中有表达,并且在TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的两种纤维化HTFs模型中,P-STAT3表达水平显著升高。免疫荧光实验结果显示激活后的P-STAT3定位于细胞核内。3.CCK-8实验结果显示,与对照组相比,S3I-201组以及STAT3 si RNA组中HTFs的增殖能力下降;细胞划痕实验和Transwell小室实验显示,与对照组相比,S3I-201组以及STAT3 si RNA组中HTFs的迁移能力下降;Western Blot和细胞免疫荧光实验显示,与对照组相比,S3I-201组以及STAT3 si RNA组中细胞Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达水平下降,应力纤维形成减少。4.CCK-8实验结果显示,与对照组相比,TGF-β1和IL-6/s IL-6R处理组的HTFs增殖能力增加,在TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的同时加入S3I-201,可抑制TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的HTFs增殖;细胞划痕实验和Transwell小室实验显示,与对照组相比,TGF-β1和IL-6/s IL-6R处理组的HTFs迁移能力增加,在TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的同时加入S3I-201,可抑制TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的HTFs迁移;Western Blot和细胞免疫荧光实验显示,与对照组相比,TGF-β1和IL-6/s IL-6R处理组的细胞Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达水平升高,在TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的同时加入S3I-201,可抑制TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达,并且应力纤维形成减少。5.Western Blot实验结果显示,HTFs在TGF-β1和IL-6/s IL-6R作用下SOCS3表达水平下降。HTFs过表达SOCS3后,LV-NC和LV-SOCS3的培养基中分别加入TGF-β1和IL-6/s IL-6R,CCK-8实验结果显示,与LV-NC组相比,LV-SOCS3组加入TGF-β1和IL-6/s IL-6R后HTFs的增殖能力下降;细胞划痕实验和Transwell小室实验显示,与LV-NC组相比,LV-SOCS3组加入TGF-β1和IL-6/s IL-6R后细胞迁移能力下降;Western Blot实验结果显示,与LV-NC组相比,LV-SOCS3组加入TGF-β1和IL-6/s IL-6R后细胞中P-STAT3、Fibronectin、CollagenI和α-SMA的表达水平下降。6.TUNEL凋亡实验结果显示,MMC组的大鼠滤过道周围结膜下组织区域可观察到大量TUNEL阳性细胞,而S3I-201组的结膜下组织中只发现少量的TUNEL阳性细胞。7.所有组动物在青光眼外滤过手术后第3天均观察到眼压较基线值眼压急剧下降。Vehicle组在术后第21天眼压开始回升,术后第28天眼压回升至基线水平。而S3I-201和MMC处理组的动物于术后第28天眼压开始出现回升,尽管S3I-201和MMC处理组的动物也表现出眼压升高,但是眼压升高的速度较Vehicle组慢。其中,S3I-201处理组在术后28天内眼压升高速度最慢。8.滤过泡生存分析表明,在青光眼外滤过手术后,Vehicle组的大鼠表现出滤过泡的快速消失,并且该组的滤过泡在第28天完全消失。与Vehicle组相比,MMC和S3I-201组的滤过泡存活时间明显更长。其中,MMC组在第14天滤过泡出现消失,第28天时滤过泡存活率为50%;而S3I-201组的滤过泡消失发生在第21天,第28天时滤过泡存活率为62.5%。9.HE染色和Masson染色结果显示,Control组可见结膜下组织结构疏松,其间可见少量成纤维细胞,胶原沉积少;Vehicle组术区结膜纤维层显著增厚,可见纤维结缔组织大量增生且排列紧密,炎症细胞和成纤维细胞增生,呈团块状生长且排列混乱,其间可见腺体及小血管增生,胶原沉积增多,呈致密或束状排列;MMC组相较于Vehicle组结膜下纤维层更为疏松,结膜下可见空洞形成,少量成纤维细胞增生,排列整齐,胶原沉积减少;S3I-201组纤维结缔组织结构疏松,可见空隙形成,成纤维细胞稀少,胶原沉积减少。组织切片免疫荧光染色显示,相较于Control组,Vehicle组手术区域的结膜下组织中Collagen-I和Fibronectin表达均升高;而与Vehicle组相比,MMC组和S3I-201组手术区域的结膜下组织中Collagen-I和Fibronectin表达均降低。结论:1.STAT3在人结膜下组织与HTFs中呈阳性表达,并且在瘢痕化的结膜下组织以及TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的纤维化HTFs中被激活。2.STAT3可促进HTFs的增殖、迁移、ECM合成以及向肌成纤维细胞表型转化。3.STAT3可介导TGF-β1非炎症依赖途径和IL-6炎症依赖途径所诱导的HTFs纤维化,是TGF-β1和IL-6促纤维化作用的共同靶点。4.TGF-β1和IL-6可通过降低SOCS3的表达水平,激活STAT3的信号通路促进HTFs纤维化。5.STAT3的特异性抑制剂S3I-201可减轻大鼠外滤过手术后的结膜下组织胶原沉积,延长低眼压维持时间和滤过泡存活时间;并且与MMC相比,S3I-201对眼组织毒性作用更小。