论文部分内容阅读
精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)体外培养体系是精子发生机理研究的基础,也为转基因新技术研发和优良家畜保种提供了新途径,目前小鼠SSCs体外培养体系较为成熟,但是,大动物培养体系尚在探索中。分析表明,机械分离结合酶消化、流式细胞分选及免疫磁珠分选法正在成为SSCs分离纯化的主要方法；作为培养体系重要成分,血清和饲养层促进了SSCs的自我更新和增殖。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell Line-derived neurotrophic factor, GDNE)在睾丸支持细胞(Sertoli cells, SCs)和SSCs之间扮演重要的角色。SCs分泌的GDNF可促进SSCs的自我更新和增殖,并抑制其分化,但随后SSCs会由于SCs的过度生长而消亡,SCs的快速生长与SSCs自我更新和增殖间的矛盾关系表明,SSCs的纯化是建立其长期培养体系的关键。为摸索出一种高效SSCs纯化方法,本文采用免疫磁珠分选法,使用干细胞抗体CD90.2进行小鼠SSCs的纯化富集。并采用流式细胞分析法和定量PCR验证了磁珠分选效率。流式细胞分析结果：免疫磁珠分选后SSCs纯度为50.11%。荧光定量PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测结果：磁珠分选后支持细胞特异表达基因GATA4显著下调(6倍)、生殖干细胞特异表达基因GFRα-1上调(6.5倍),SSCs表达基因OCT4极显著上调(5.7倍),三个基因相对表达量的变化说明,免疫磁珠可有效地将SSCs从SCs中分离出来。分选后的SSCs经过培养后数量增多,克隆团增大,使用形态学分离法对培养后的SSCs进行分离传代培养。采用碱性磷酸酶试剂盒染色、免疫荧光染色、逆转录-聚合酶链式反应对不同培养时期的SSCs进行鉴定。培养4d、8d、18d,34d的细胞均可被碱性磷酸酶染成深色；培养7d、14d的细胞免疫荧光染色时表达GFRα-1;通过PT-PCR分析在培养26d的SSCs样品中检测到了精原干细胞标记基因OCT4、GFRα-1的表达,而在培养36d的细胞样品中没有检测到OCT4的表达,只检测到了GFα-1的表达。这结果说明,利用磁珠分选联合形态学分离法,在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行SSCs培养,可使SSCs在保持干细胞活性的条件下连续培养35d左右。