林可霉素是一类具有重要临床意义的高效广谱抗生素,广泛应用于革兰氏阳性菌引起的疾病治疗。通过长期的菌种选育和生产工艺优化,现有工业生产菌株的产量已经达到7 g/L以上,相比林可霉素野生型产生菌提高了200倍以上。此外还发现在发酵培养基中加入浓度为0.8%的硝酸钠时,林可链霉菌NRRL2936的林可霉素产量可提高约70%,这就是所谓的硝酸盐效应。本研究对林可霉素野生型产生菌NRRL2936和高产菌株LC-G进行了全基因组精细图谱的测定,通过比较基因组和比较转录组学的分析,初步阐述了林可霉素的高产机制;并在全基因组精细图谱的基础上解析了林可霉素生物合成中存在的硝酸盐效应的机制。首先应用454测序技术测定了NRRL2936的基因组草图序列,在此基础上,利用meta-pair技术提供contig末端信息并结合数据分析及PCR等分子生物学技术填补了草图中的缺口。最后通过特殊的末端片段克隆方法识别了NRRL2936基因组的两个端粒,成功构建了它的完整、精细基因组图谱。NRRL2936染色体为线形染色体,长度为10,319,054 bp,并且在两个末端存在着约24 kb的重复片段。与其他链霉菌基因组比较发现,NRRL2936中存在相对较大的核心区(6.99 Mb),左右两臂大小分别为1.67 Mb和1.66 Mb。林可霉素合成基因簇位于染色体非核心区,靠近染色体的末端,距离左端仅24 kb。同时发现NRRL2936染色体中至少还存在着31个其他潜在的次级代谢生物合成基因簇,包括5个聚酮(PKS)、5个非核糖体肽类(NRPS)、3个杂合聚酮-多肽(PKS-NRPS)、6个萜类(terpene)、3个铁载体类(siderophore)、2个丁内酯类(butyrolactone)和7个其它类型的基因簇,其中绝大多数基因簇位于染色体的非核心区。在实验室摇瓶发酵条件下,野生型NRRL2936和高产菌株LC-G林可霉素的产量分别为55.7±12.8 mg/L和970±66.4 mg/L。为了阐述林可霉素的高产机制,我们进一步测定了林可霉素高产菌株LC-G的全基因组序列。其染色体大小为9,513,637 bp,比野生型NRRL2936小约805.42 kb。主要差别为LC-G染色体右臂有两个大片段的缺失,大小分别为24.74 kb和776.58 kb,共编码638个蛋白。我们在野生型NRRL2936中分别敲除了这两个片段,林可霉素产量从55.7±12.8mg/L分别提高到77.7±11.6 mg/L和680±53.9 mg/L,其中较大片段(DEL-I)缺失突变株的产量已经能够到达高产菌株的70%,是导致LC-G高产的主要因素。通过qRT-PCR和生物量测定发现,DEL-I缺失后林可霉素生物合成基因表达水平没有显著变化而生物量有明显降低,提示可能是生长潜力转化为了抗生素产量。另外,两个基因组间还存在25个InDel和129个SNV位点的突变。高产菌株线形染色体上还存在多重的倒置和重排,这种现象在其它链霉菌中并不多见。通过野生型NRRL2936和高产菌株LC-G在工业发酵培养基条件下转录组芯片的分析,发现共有821个基因表达发生了显著变化,包括林可霉素生物合成基因和许多与初级代谢(碳代谢、氮代谢等)相关基因,导致林可霉素生物合成基因簇和磷酸戊糖途径表达水平提高,同时糖酵解途径和TCA循环发生弱化。在林可链霉菌NRRL2936的染色体上,一共发现了两套在放线菌中较为少见的硝酸盐特异性的ABC转运蛋白基因。分别将这两套ABC转运蛋白基因从染色体上敲除,细胞内硝酸盐浓度从66.9±6.8μg/mL分别降至56.3±3.1μg/mL和50.9±1.5μg/mL,进一步的组合缺失使细胞内硝酸盐浓度降低到48.8±3.4μg/mL;而对应突变株林可霉素的产量则分别会降低21.0%、31.4%和35.9%。此外qRT-PCR分析表明,林可霉素发酵过程中添加0.8%的硝酸盐可明显提高氮代谢全局性调控因子glnR转录水平,glnR正调控ABC转运蛋白基因、硝酸盐还原酶基因、亚硝酸盐还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、林可霉素抗性基因lmrA。因此,硝酸盐通过诱导glnR转录进而促进整个硝酸盐同化途径的代谢水平,增加细胞内谷氨酸的积累,谷氨酸通过转氨作用形成林可霉素合成的前体物质酪氨酸。另外,林可霉素抗性基因lmrA的高表达可以促进林可霉素的外排,提高菌株对林可霉素的抗性。通过比较基因组我们还发现地中海拟无枝酸菌中存在特异性的亚硝酸盐内运蛋白基因nirC,分别将硝酸盐特异性ABC转运蛋白基因和亚硝酸盐特异性转运蛋白基因导入天蓝色链霉菌M145中,均可使放线紫红素的产量提高,同时glnR的表达水平也有所提高。于是我们构建了nirC-ABC2模块,并将其引入天蓝色链霉菌M145、白色链霉菌BK3-25、珍贵束丝放线菌ATCC31280、林可链霉菌LC-G、吸水链霉菌XM201中,使得放线紫红素、盐霉素、安丝菌素、林可霉素和格尔登素在相应发酵条件下都有不同程度的提高。综上所述,本研究通过林可链霉菌野生型和高产型菌株比较功能基因组和转录组的分析,从代谢和转录水平阐述林可霉素的高产机制;并且在林可霉素野生型产生菌NRRL2936全基因组精细图谱的基础上,阐明了林可霉素生物合成的硝酸盐效应机制,同时构建的nirC-ABC2模块可作为其他次级代谢产物代谢工程改造的一种新的工具。