沉默GOLPH3对肝细胞癌化疗敏感性影响的体内外实验研究

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目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国发生率与死亡率最高的恶性肿瘤之一;部分HCC患者在就诊时往往已属晚期,失去手术治疗机会,且容易发生侵袭与转移,预后较差。肝细胞癌对化疗药物不敏感一直是治疗肝细胞癌的难点。高尔基体磷蛋白3(Golgi phosphoprotein3,GOLPH3)主要定位在高尔基体外侧网络(TGN),在细胞生理中起着重要的作用,主要在高尔基形态维持、囊泡运输、蛋白糖基化、受体分配、线粒体功能等五个方面发挥作用。GOLPH3作为一种新的癌基因,由Kenneth L.Scott基于对人类癌症的全基因组拷贝数的分析,发现5p13位点在多种类型的实体肿瘤,如肺癌,卵巢癌,乳腺癌,前列腺癌和黑色素瘤中,呈现明显的扩增趋势。有研究报道肿瘤组织中GOLPH3高表达可以提高以5-Fu为基础辅助化疗的结直肠癌患者的预后效果,增加结直肠癌细胞中GOLPH3的表达也可以提高肿瘤细胞对5-Fu化疗药物的敏感性。但值得注意的是,有报道沉默口腔鳞状细胞癌细胞GOLPH3表达可通过调节Caspase-3,Bcl-2和cytochrome-c的表达来提高化疗效果  方法:应用RT-PCR和Western blot技术检测8株肝细胞癌细胞系(Huh7、BEL-7402、HCCLM3、HepG2、SMMC-7721、SKHEP1、MHCC97H、MHCC97L)和一株正常肝细胞细胞系(HL-7702)中GOLPH3在mRNA及蛋白水平的表达情况。选择GOLPH3相对高表达细胞系,使用siRNA构建干扰的GOLPH3肝细胞癌细胞系,通过AnnexinⅤ-PI染色法,流式细胞仪检测5-FU,ADM, Cyclophosphamide,OXA对肝细胞癌细胞化疗药物敏感性的影响。使用慢病毒感染的方式构建稳定的GOLPH3干扰的huh7细胞系,通过裸鼠体内体内成瘤实验,检测GOLPH3在体内环境下对肿瘤生长及化疗药物敏感性的影响。筛查与细胞凋亡相关的基因,探究GOLPH3影响肝细胞癌化疗敏感性可能的分子机制。  结果:通过RT-PCR和Western blot技术检测8株肝细胞癌细胞系(Huh7、BEL-7402、HCCLM3、HepG2、SMMC-7721、SKHEP1、MHCC97H、MHCC97L)中GOLPH3的mRNA及蛋白表达水平结果明显高于正常肝细胞细胞系(HL-7702),其中huh7和SMMC-7721呈现相对高表达。使用siRNA沉默huh7和SMMC-7721的GOLPH3表达,流式细胞仪结果显示GOLPH3干扰组应用5-FU,ADM,Cyclophosphamide,OXA后,其凋亡比例明显高于对照组(P<0.05),两组细胞凋亡能力差异具有统计学意义。使用慢病毒感染的方式构建稳定的GOLPH3干扰的huh7细胞系后,通过裸鼠体内成瘤发现,干扰GOLPH3组,肝细胞癌体内成瘤速度明显低于正常对照组,且使用化疗药物阿霉素后,干扰GOLPH3组的肿瘤抑制作用明显强于对照组。  结论:干扰GOLPH3可增加5-FU、OXA、ADM、Cyclophosphamide等化疗药物所致肝细胞癌细胞的凋亡;裸鼠体内研究证实干扰GOLPH3可抑制肿瘤生长,并可以增加化疗药物对肿瘤生长的抑制作用。
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