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白介素-2(Interleukin-2,IL-2)是一种具有多功能免疫调节作用的细胞因子,由于在人体内半衰期短因此在临床应用时受到限制。本研究室前期工作中,将人血清白蛋白(HSA)与人IL-2(HSA/IL-2)融合并先后在毕赤酵母、CHO细胞两种表达体系中成功表达。毕赤酵母缺乏完善的翻译后修饰功能,蛋白糖基化形式不完全,蛋白质存在降解等问题。CHO细胞表达HSA/IL-2时在一定程度上解决了酵母表达体系的问题,且蛋白具有良好的生物活性,提高了HSA/IL-2的成药性。但CHO细胞培养存在以下问题:(1)实验室前期使用的无血清培养基和流加培养基含多种蛋白成分,培养基性质不稳定,培养基不易保藏;(2)摇瓶培养规模小,不能满足HSA/IL-2的后续研究及产业化发展。本课题将以此为出发点,筛选并优化CHO细胞的培养基体系,并探究CHO细胞在搅拌式生物反应器中的培养工艺。为解决培养基问题,考察了四种商业化无血清培养基的特性,完成细胞悬浮驯化。结合CHO细胞生长密度和活率,筛选出最优基础培养基M1。通过流加培养方式,筛选出最优流加培养基F3。通过添加蛋白水解物(酵母提取物、大豆蛋白水解物、胰蛋白水解物)和小分子促进剂(丁酸钠、丙戊酸、DMSO)提高细胞密度和融合蛋白表达量。结果表明:培养基中添加4 mM的丙戊酸提高融合蛋白的表达效果最好,最高表达量为72mg/L,是对照组的1.24倍。不同浓度的水解物对细胞生长及融合蛋白表达效果不同,确定最优添加浓度为5 g/L。不同水解物对细胞生长及融合蛋白表达效果不同,酵母提取物(YE)提高细胞生长密度及融合蛋白表达量效果最明显,最高生长密度为9.95×106cells/mL,是对照组的1.43倍,HSA/IL-2最高表达量为100 mg/L,是对照组的1.72倍。YE可以提高细胞周期G1期比例和降低细胞凋亡率的作用。为实现大规模培养重组CHO细胞,本课题对搅拌式生物反应器的培养工艺进行了研究。利用反应器培养CHO细胞时,因流体动力产生的剪切力对细胞生长有着显著的影响作用,消泡剂添加浓度、通气量、搅拌速率等参数进行研究。结果显示:(1)添加一定浓度的消泡剂可以很好地解决泡沫问题,消泡剂添加浓度范围应为0~0.05%;(2)不同的通气量和搅拌速率对细胞生长影响差异明显,最适通气量范围为0.05~0.1 L/min,最适搅拌速率为200 rpm;(3)利用反应器进行CHO细胞流加培养时,细胞最高生长密度为7.4×106 cells/m L,低于摇瓶水平,最高融合蛋白表达量为120 mg/L;(4)依据摇瓶实验,通过添加5 g/L的YE优化细胞培养过程,实现了提高细胞生长密度及目的蛋白表达量,CHO最高生长密度提高至9.9×106 cells/mL,最高融合蛋白表达量提高至130mg/L。利用SDS-PAGE检测培养上清液,82 kDa左右存在融合蛋白的条带。经Western blot检测,目的蛋白具有HSA和IL-2的双重抗性。利用CTLL-2/MTT法检测培养上清液发现其具有体外生物活性。