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目的:2型糖尿病是一种常见病和多发病,已成为世界范围的老年健康问题。每年约有数以百万糖尿病患者因其并发症致残或死亡,造成严重的社会及经济负担。糖尿病性骨质疏松是其中一种并发症,随着我国人口老龄化发展,其发病率逐年增加。因此如何早期诊治,预防骨质疏松发生,减少致残、致死率,已成为世人尤以关注的社会问题。国内外研究表明破骨细胞在糖尿病骨质疏松发病机制中至关重要。破骨细胞数量和功能与糖尿病性骨质疏松发生密切相关。TRACP5b是破骨细胞特异性标志酶,血清TRACP水平反映体内破骨细胞活性和骨吸收状态,其特异性高,不受昼夜变化、饮食、肝肾疾病影响。本研究在建立2型糖尿病骨质疏松大鼠模型基础上,通过体外破骨细胞培养及血清TRACP5b浓度测定,观察在不同时间正常、骨质疏松、2型糖尿病、2型糖尿病骨质疏松大鼠中破骨细胞及TRACP5b变化,从细胞水平探讨破骨细胞在2型糖尿病骨质疏松发生、发展过程中的作用。方法:2.5~3月龄雌性Wistar大鼠100只,适应性喂养1周后随机分为正常对照组(NC组)24只、正常去卵巢组(NOVX组)26只、2型糖尿病组(DC组)24只、2型糖尿病去卵巢组(DOVX组)26只。组间大鼠体重无统计学差异。实验期间NC组和NOVX组常规饲料,DC组和DOVX组大鼠高糖高脂饲料(常规饲料中加入20%蔗糖、15%熟猪油、2.5%胆固醇)喂养8周,禁食12小时后左下腹腔给予链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),( STZ,0.1mmol/L,柠檬酸钠配制,pH4.2)30mg/kg注射。于实验第9周末选取尾静脉空腹血糖(FBG)≥7.8mmol/L且伴有胰岛素抵抗者作为2型糖尿病动物模型(type 2 diabetes mellitus,T2DM),T2DM动物模型复制成功1周后无菌条件下NOVX组和DOVX组大鼠麻醉后行双侧卵巢切除手术。手术当天(0周)各组各取一只大鼠收集骨髓细胞行体外破骨细胞培养作为基值。实验共持续22周。第0、2、4、6、8、10、12周末各组大鼠测体重、血糖、TRACP5b、胰岛素;第4、8、12周末各组随机选取一只大鼠拉颈处死。体外骨髓破骨细胞培养:75%乙醇浸泡大鼠10~15分钟。无菌条件下取股骨,分离周围组织,切断股骨两端骨骺,用含4mlα-MEM注射器冲洗骨髓腔2次,无菌离心管收集骨髓冲洗液,离心;培养液稀释细胞浓度为1.5×106/ml,将此细胞悬液置于24孔培养板内,0.5ml/孔。培养液为α-MEM,其中含10%胎牛血清、30ng/ml sRANKL、10ng/ml M-CSF、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素;每2~3天更换培养液,置于5%CO2和37℃培养箱内培养。破骨细胞染色和计数:细胞培养7天后,固定细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色。TRAP染色阳性且细胞核数≥3个认定为破骨细胞,倒置相差显微镜下每孔计数。血清TRACP5b采用ELISA法测定。所有实验数据均采用均数±标准差( x±s)表示,计量资料多组间比较采用方差分析或秩检验,p<0.05认为有统计学意义。结果:1不同时间各组大鼠体重、血糖、胰岛素比较结果1.1体重比较NOVX组、NC组大鼠体重均呈增加趋势,且NOVX组大鼠因去卵巢体重增加明显,DOVX组大鼠体重无明显变化,DC组大鼠因糖尿病体重呈减轻趋势。0周NC与DC、DOVX组两两之间无显著差异(p>0.05),NC与NOVX之间无显著差异(p>0.05),NOVX组与DC、DOVX组之间存在显著差异(p<0.05),2周NOVX组体重均显著高于其他各组(p<0.05),NC、DC、DOVX组两两之间无显著差异(p>0.05)。4周DC组体重最低且与NC、NOVX组有显著差异(p<0.05),NOVX组体重均高于其他各组且有显著差异(p<0.05)。6周与8周任意两组之间比较均有显著差异(p<0.05),DC组体重最低,NOVX组体重最高。10周DC组体重均低于其余各组且有显著差异(p<0.05),NOVX组体重均高于其余各组且有显著差异(p<0.05)。12周NOVX组与其余各组之间比较均有显著差异(p<0.05),DC组与NC组之间有显著差异(p<0.05),而DOVX与DC、NC组之间无显著差异(p>0.05)。1.2血糖比较结果0周糖尿病组(DC、DOVX)FBG显著高于非糖尿病组(NC、NOVX) ( p<0.05)。2周DC组、DOVX组FBG出现下降趋势,DC组FBG显著高于NC组、NOVX组(P<0.05),DOVX组FBG显著高于NOVX组(P<0.05), NC组FBG与NOVX组相比无显著差异(P>0.05),DOVX组FBG高于NC组但无显著差异(P>0.05)。4周DC组、DOVX组FBG继续呈下降趋势,且各组之间FBG无显著差异(P>0.05)。6周DC组、DOVX组FBG显著高于NC组、NOVX组(P<0.05),NC组FBG与NOVX组、DC组FBG与DOVX组之间均无显著差异(P>0.05)。8周DC组、DOVX组FBG显著高于NC组、NOVX组(P<0.05),FBG在NC组与NOVX组、DC组与DOVX组之间均无显著差异(P>0.05)。10周各组之间FBG均无显著差异(P>0.05)。12周各组之间FBG均无显著差异(P>0.05)。1.3胰岛素比较结果0周:糖尿病组(DC、DOVX)显著高于非糖尿病组(NC、NOVX) (p<0.05)2周:DC组显著高于NC、NOVX、DOVX组(p<0.05),NOVX组显著低于其他三组(p<0.05)。DOVX组与NC组之间无显著差异(p>0.05)。4周:DC组显著高于NC、NOVX、DOVX组(p<0.05),其余各组两两之间比较无显著差异(p>0.05)。6周:各组之间两两比较无显著差异(p>0.05)。8周:DC、DOVX组显著高于NOVX组(p<0.05),其余各组两两之间比较无显著差异(p>0.05)。10周与12周:各组之间两两比较无显著差异(p>0.05)。2不同时间大鼠破骨细胞计数、血清TRACP5b比较结果2.1破骨细胞计数比较结果0周各组间比较均无显著差异。4周与8周结果显示DOVX组破骨细胞计数均高于其他各组,但与NOVX之间无显著差异(p>0.05),NC组均低于其他各组(p<0.05)。12周结果显示DC组与NOVX组之间无显著差异(p>0.05),NC组破骨细胞计数均明显低于其他各组(p<0.05),DOVX组显著高于其他各组(p<0.05)。2.2血清TRACP5b结果0周任意两组之间比较均无显著性差异(p>0.05)。2周NOVX组、DOVX组浓度明显高于DC、NC组(p<0.05),NC组浓度明显低于其他各组(p<0.05), NOVX与DOVX组之间无显著差异(p>0.05)。4周NC组浓度明显低于其余各组(p<0.05),NOVX组浓度显著高于DC、DOVX组(p<0.05),DC组与DOVX组之间无显著差异(p>0.05)。6周NC组浓度显著低于其他各组(p<0.05),NOVX组、DC组与DOVX组之间无显著差异(p>0.05)。8周各组两两之间比较均无显著差异(p>0.05)。10周NC组浓度明显低于其他各组(p<0.05),DC组,NOVX组,DOVX组之间无显著差异(p>0.05)。12周DOVX组浓度均高于其他各组且有显著差异(p<0.05),NC组、NOVX组、DC组之间无显著差异(p>0.05)。3相关分析结果3.1破骨细胞计数与血清TRACP5b相关分析结果破骨细胞数量与血清TRACP5b浓度呈正相关(r=0.789,p<0.000)。3.2破骨细胞数量、血清TRACP5b浓度与血糖相关分析结果破骨细胞数量与血糖水平无相关性(r=-0.290,p=0.275),血清TRACP5b浓度与血糖无相关性(r=-306,p=0.249)。结论:1 2型糖尿病和切除卵巢均促进骨髓诱导破骨细胞形成,破骨细胞数量增加可能是2型糖尿病骨质疏松大鼠骨量丢失的原因之一;2 2型糖尿病骨质疏松大鼠血清TRACP5b浓度较正常对照组显著升高,为早期监测糖尿病骨质疏松、预防其发生提供依据;3 2型糖尿病骨质疏松发生发展过程中,破骨细胞数量和血清TRCP5b浓度不随病程延长而改变,保持在相对稳定状态;4破骨细胞数量与血清TRACP5b浓度呈正相关;5破骨细胞数量、血清TRACP5b浓度与血糖水平无相关性。