研究背景及目的:研究背景:宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤,好发于中青年女性。鳞状细胞癌,（简称鳞癌,Squamous cell carcinoma,SCC）是宫颈癌最常见病理组织类型,约占宫颈癌的80%～85%。虽然90%以上的早期宫颈癌通过手术、化疗和放疗可以得到治愈,但仍有部分中晚期宫颈癌预后不佳。复发和转移是导致宫颈癌患者死亡的主要原因,宫颈癌的转移途径包括淋巴道转移和血道转移,血道转移常常转移至肺及骨骼等器官。目前在临床病理诊断中,对于转移性鳞状细胞癌与受累器官原发鳞癌的鉴别,以及判断原发灶来源,尚无有效的手段。众所周知,人乳头状瘤病毒（human papilloma virus,HPV）已被确定为宫颈癌的主要致病因素,大约90%的宫颈癌的发生与HPV感染相关。高危型HPV,尤其HPV16和18亚型是宫颈癌最主要的致病因素。目前,宫颈脱落细胞HPV检测已成为早期宫颈癌筛查的重要手段,但在转移性宫颈癌,尤其在石蜡包埋宫颈癌组织中的研究,报道甚少。HPV DNA整合到宿主细胞基因组是宫颈癌发生、发展的关键步骤。E6、E7是高危型HPV（HR-HPV）编码的两种致癌蛋白,它们对病毒复制以及宿主细胞的转化至关重要。当HPV DNA整合到宿主细胞基因组后,E6蛋白通过p53途径（p14-MDM2-p53通路）、E7蛋白通过p Rb途径（p16INK4a-细胞周期蛋白D1-CDK4-RB通路）干扰细胞周期,促进肿瘤的发生。因此,E6/E7蛋白或m RNA是HPV DNA整合到宿主细胞基因组中的重要标志。目前,临床上已将宫颈脱落细胞E6/E7 m RNA检测作为早期宫颈癌筛查的重要手段之一,但在转移性宫颈癌组织中,尤其在石蜡包埋组织中用免疫组化染色方法检测HPV-E6蛋白的表达,探讨其作为诊断转移性宫颈癌的生物标记物的可行性,尚未见研究报道。p16蛋白高表达已成为诊断HPV相关性癌的重要证据,也是鉴别宫颈癌与其他癌的重要标记物。目前,在临床病理诊断中已将p16免疫组化染色作为辅助诊断宫颈癌或鳞状上皮内高度病变（一种宫颈癌前病变）的重要手段,但是p16在转移性宫颈癌组织中的研究,尤其与HPV DNA检测阳性率的关系,研究报道甚少。广谱HPV蛋白是HPV DNA保守区L1基因编码的L1衣壳蛋白,通过免疫组织化学染色方法检测组织中广谱HPV蛋白是诊断HPV感染的证据之一,但是其作为转移性宫颈癌的诊断标记物,尚未见文献报道。目的:本研究利用宫颈癌与HPV感染相关的特点,研究HPV及相关生物标记物在宫颈鳞状细胞癌原发灶和转移灶组织中的表达,探讨其作为转移性宫颈癌诊断标记物的可行性,为临床提供可靠的诊断依据。方法:1.收集大连医科大学附属第二医院病理科2009年9月-2019年1月临床病理资料完整的存档蜡块共87例（103个蜡块）,患者均为女性。其中伴有淋巴结转移的宫颈鳞状细胞癌16例,包括宫颈原发灶（宫颈鳞癌组）及相应的淋巴结转移灶（淋巴结转移组）,均为手术标本;宫颈鳞状细胞癌肺转移灶（简称肺转移组）12例,其中手术标本5例,活检及穿刺标本7例;原发肺鳞状细胞癌（简称肺鳞癌组）29例,均为手术标本。另选尖锐湿疣组、宫颈低度鳞状上皮内病变组（LSIL）及高度鳞状上皮内病变组（HSIL）各10例,均为活检标本。2.采用PCR-膜杂交的方法,检测各组鳞状细胞癌组织中HPV亚型。3.采用免疫组化的方法,检测各组鳞状细胞癌组织中p16,HPV16-E6蛋白及广谱HPV蛋白的表达情况。4.分析上述标记物在宫颈癌原发灶和转移灶中表达的差异和各个指标之间的相关性,以及与临床病理参数的关系。5.用SPSS 22.0软件对实验数据进行分析,计数资料的组间比较采用χ~2检验、Fisher确切概率法;两变量间的相关性使用Spearman相关系数;两种检测方法的一致性检验用kappa检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.HPV PCR-膜杂交结果本组16例宫颈鳞癌组和淋巴结转移组的HPV检出率均为75.0%;12例宫颈鳞癌肺转移组HPV检出率为91.7%;29例原发肺鳞癌组均未检出HPV DNA;宫颈癌原发灶与转移灶HPV亚型高度一致,均以HPV16型占绝对优势。2.p16蛋白的表达16例宫颈鳞癌组和淋巴结转移组及12例宫颈鳞癌肺转移组的p16蛋白表达均以中等到弥漫强阳性为主,阳性表达率均为100%;29例原发肺鳞癌组p16蛋白阳性率（34.5%）显著低于宫颈鳞癌组和淋巴结转移组以及肺转移组（P<0.01）。p16抗体的灵敏度97.2%（35/36）,特异度为56.7%（21/37）。3.HPV16-E6蛋白的表达本组HPV16型阳性宫颈癌（包括宫颈癌原发灶、淋巴结转移灶及肺转移灶）共33例,HPV16-E6在宫颈鳞癌组、淋巴结转移组及肺转移组中的阳性率分别为63.6%（7/11）,36.4%（4/11）及72.7%（8/11）;三组之间的阳性率差异无统计学意义（χ~2=3.226,P>0.05）。HPV16-E6抗体的灵敏度61.2%（19/31）,特异度为100%（2/2）。4.广谱HPV蛋白的表达本研究共检测50例样本,包括宫颈鳞状细胞癌原发灶、淋巴结转移灶、宫颈高度鳞状上皮内病变、宫颈低度鳞状上皮内病变及尖锐湿疣各10例,其中广谱HPV蛋白在宫颈鳞状细胞癌原发灶和淋巴结转移灶中检测结果均为阴性;在宫颈高度鳞状上皮内病变和低度鳞状上皮内病变及尖锐湿疣组织中,广谱HPV蛋白阳性率分别为10%（1/10）,10%（1/10）和70%（7/10）。5.蛋白表达与临床病理参数的关系未发现p16蛋白表达与宫颈癌临床病理参数的相关性。在宫颈鳞癌组HPV16-E6的表达与肿瘤分期成正相关（rs=0.608,p<0.05）。在肺转移组,HPV16-E6蛋白的表达与组织分化程度成负相关（rs=-0.754,p<0.05）。结论:1.用PCR-膜杂交方法检测石蜡包埋组织中HPV DNA具有可行性;转移灶中检出高危型HPV DNA是诊断转移性宫颈鳞状细胞癌的特异性指标;2.p16蛋白高表达可作为诊断淋巴结内转移性宫颈鳞状细胞癌的特异性指标;3.p16免疫组化染色方法敏感性高于HPV DNA检测方法,p16蛋白可作为HPV相关性癌初诊标记物;HPV16-E6和广谱HPV蛋白在宫颈鳞状细胞癌及其转移灶中检出率低,不适于作为诊断转移性宫颈鳞状细胞癌的标记物;4.HPV16-E6蛋白表达与宫颈鳞状细胞癌的分化程度呈负相关,与肿瘤的临床分期呈正相关,提示HPV16-E6蛋白可能是判断宫颈癌预后的潜在标记物。