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植物纤维素作为自然界中利用潜力最大的可再生资源,每年全球产量高达5×1010吨。有效转化和利用这些丰富的资源,对于解决人类面临的能源危机、食品短缺、环境污染等有着非常重要的意义。近年来,利用纤维素酶高效分解农作物秸秆产糖已经成为国内外研究重点。然而,纤维素酶酶活较低是导致其生产成本过高,限制其大规模使用的主要原因。针对这个问题,本文以康宁木霉为出发菌株,分别从菌株诱变选育、发酵产酶条件优化、CMCase的分离纯化及酶学性质研究的角度进行了研究和讨论。
1.利用N+注入技术对康宁木霉孢子进行诱变处理,用不同剂量N+注入后,菌体存活率呈现“马鞍型”曲线,综合考虑菌株的存活率、总突变率和正突变率,确定最佳诱变剂量为12.5×1014 ions/cm2。在最佳诱变剂量下对康宁木霉孢子进行反复诱变,筛选得到一株遗传稳定性良好的高产菌株HF-6,发酵120 h,其滤纸酶活及CMCase酶活分别为0.217 U/mL及3.526 U/mL,较出发菌株分别提高49.66％及42.81％。
2.在单因素试验基础上通过Plackett-Burman设计法对影响突变株HF-6产纤维素酶的主要因素进行筛选,得到三个影响显著的因素分别为pH、硫酸铵浓度和装液量。利用Box-Behnkon设计法对这三个影响显著的因素进行响应面优化分析,确定突变株HF-6产纤维素酶的最佳发酵工艺参数为:玉米秸秆20 g/L,麸皮20 g/L,硫酸铵4.43 g/L,硫酸镁0.5 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,乳糖4 g/L;初始pH5.75,接种量2 mL,培养温度29℃,装液量65 mL,转速210 r/min。将突变株HF-6在最佳发酵工艺参数下进行发酵,其滤纸酶活及CMCase酶活分别为0.231 U/mL及3.977 U/mL。
3.采用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤层析及HiTrap TM Q HP阴离子交换层析的方法依次对康宁木霉突变株HF-6所产CMCase进行了分离纯化,最终获得电泳纯CMCase,纯化倍数为7.144倍,回收率为13.828％,经SDS-PAGE凝胶电泳显示CMCase分子量为58.8 kDa。
4.酶学性质研究表明:CMCase最适反应温度为50℃,在60℃以下时,酶能够保持相对稳定;最适反应pH为5.0,在pH4～7,4℃保存20h剩余相对酶活仍在60％以上。不同金属离子对CMCase具有不同的影响,Ca2+、Mg2+及Mn2+对CMCase酶活有激活作用,其中Ca2+的激活作用最大;Zn2+、Cu2+、Fe3+及Co2+对CMCase酶活有抑制作用,其中Cu2+的抑制作用最强烈:Na+对CMCase酶活没有太大影响。CMCase对底物CMC的动力学常数Km及最大反应速率Vmax分别为2.254 mg/mL及0.0382 mg/min/mL。