论文部分内容阅读
目的：（1）探讨心脏营养素-1（Cardiotrophin-1，CT-1）及其受体亚基gp130，LIFR-β（白血病抑制因子受体-β）在失神经骨骼肌中的表达规律，为应用CT-1治疗失神经骨骼肌萎缩提供理论依据。（2）观察外源性CT-1对失神经骨骼肌的营养和保护作用。（3）观察经CT-1治疗后的失神经骨骼肌在重获神经支配后的功能恢复情况。（4）初步探讨CT-1延缓失神经骨骼肌萎缩的作用机制。（5）观察应用不同剂量的外源性CT-1对其他组织和器官的作用，探讨CT-1的副作用，并明确应用CT-1治疗失神经骨骼肌萎缩的有效剂量和安全剂量，为临床应用奠定基础。方法：（1）选用11组Swiss小鼠，每组10只，切断其右侧胫神经，分别于0，6，12h和1，3，5，7，10，14，21，28d完整切取右侧腓肠肌，用Northern blot法测定失神经腓肠肌中CT-1和LIFR-β，gp130的mRNA含量，探讨3者的表达规律。（2）另取Swiss小鼠30只，同样方法切断其胫神经后，连续腹腔注射CT-1（100μg／kg／d），于7、14和28d后检测失神经腓肠肌的湿重、肌纤维横截面积和肌肉总蛋白含量、超微结构以及肌张力的变化，分别与对照组比较，观察CT-1能否减轻失神经腓肠肌萎缩的程度。（3）将胫神经切断后的60只小鼠，随机分成6组，每组10只，其中3组每日腹腔注射rmCT-1（100μg／kg／d），另外3组作为对照，每日腹腔注射等量CT-1溶媒。一个月后，停止给药，再次手术，行胫神经的修复。分别于神经修复后4、8和12w检测重获神经支配的腓肠肌复合肌肉动作电位、肌张力、湿重和总蛋白含量，以及再生胫神经有髓纤维计数和坐骨神经诱发电位潜伏期的变化。观察经CT-1治疗后的失神经腓肠肌在重获神经支配后的功能恢复情况。（4）从失神经骨骼肌细胞凋亡、蛋白代谢、兴奋-收缩耦联、肌卫星细胞状态等方面对CT-1延缓失神经骨骼肌萎缩的机制进行探讨。用TUNEL法检测小鼠失神经腓肠肌细胞的凋亡率，用Northern blot法检测凋亡相关蛋白Fas和Bcl-2的表达变化，观察CT-1对失神经骨骼肌细胞凋亡的影响；用Northern blot法检测小鼠腓肠肌失神经后收缩蛋白中α-actin和MHCⅡa的变化，用Western blot法检测失神经腓肠肌中保护性蛋白HSP70和HSP90的含量，观察CT-1对失神经骨骼肌收缩蛋白和保护性蛋白合成的影响；用Northern blot法检测小鼠腓肠肌失神经后蛋白水解途径中泛素和调节复合物RC2的表达，用HPLC法检测失神经腓肠肌中MeHis的释放量，观察CT-1对失神经骨骼肌蛋白水解过程的影响；用Western blot法检测小鼠腓肠肌失神经后肌浆网Ca2+-APTase的含量，观察CT-1对失神经骨骼肌收缩功能的影响；用电镜检测小鼠腓肠肌失神经后肌卫星细胞的形态学变化，观察CT-1对失神经骨骼肌肌卫星细胞活跃程度的影响。（5）取Swiss小鼠80只，随机分成8组，分别于胫神经切断术后连续腹腔注射rmCT-1 40、60、80、100、120、140、160μg／kg／d，剩余一组作为对照，腹腔注射等体积CT-1溶媒，28天后称量失神经侧腓肠肌、正常侧腓肠肌和心脏的湿重；测量胸主动脉平滑肌厚度；用Northern blot法检测正常腓肠肌中α-actin和MHCⅡa以及心肌中β-MHC的表达；用Western blot法检测胸主动脉血管平滑肌细胞中α-actin的含量，探讨应用CT-1防治失神经骨骼肌萎缩时，可能对正常骨骼肌、心肌和血管平滑肌产生的副作用，以及应用CT-1治疗失神经骨骼肌萎缩的有效剂量和安全剂量。结果：（1）CT-1及其受体gp130／LIFR-β在正常骨骼肌中均有表达。胫神经切断后，腓肠肌中CT-1的表达进行性下降；而LIFR-β和gp130在早期均有一个表达增高的过程，前者的表达高峰出现在失神经支配后24小时，后者在神经切断后1周表达最高。（2）连续应用外源性CT-11周时，即改善了失神经骨骼肌的肌张力，减轻了肌浆网的扩张程度，用药2周时，有效地维持了失神经腓肠肌的湿重、肌纤维横截面积和总蛋白含量。用药4周后，这种效果更加明显。（3）在对再生神经轴突数量和功能的检测中发现，CT-1注射组和溶媒注射组的神经轴突的数量和再生神经潜伏期均无明显差异。但经CT-1治疗后，神经再支配腓肠肌的湿重、肌纤维截面积、肌肉总蛋白含、CMAP波幅和肌张力均有明显改善。（4）外源性CT-1的应用抑制了失神经骨骼肌细胞Fas mRNA的表达、促进了Bcl-2 mRNA的表达、降低了失神经骨骼肌细胞的凋亡率；促进了骨骼肌细胞收缩蛋白的α-actin、MHCⅡa mRNA的表达，和保护性蛋白HSP70、HSP90的合成；提高了失神经骨骼肌肌浆网Ca2+-ATPase的含量。但对失神经骨骼肌蛋白水解途径中泛素和调节复合物RC2 mRNA的表达、失神经骨骼肌中MeHis的释放量、以及神经骨骼肌肌卫星细胞的活跃程度均无无明显影响。（5）采用腹腔注射这种给药途径来治疗失神经骨骼肌萎缩时，当CT-1用量达到60μg／kg／d时，即可对失神经骨骼肌产生营养作用，随着给药剂量的增加，CT-1对失神经骨骼肌的营养作用也在不断增强，但当给药剂量超过100μg／kg／d后，CT-1的营养作用虽然还在增加，但已经逐渐开始出现导致正常骨骼肌、心肌和血管平滑肌的副作用，当给药剂量达到120μg／kg／d时，开始促进心肌β-MHC mRNA的表达，增加正常心脏的湿重。当给药剂量达到140μg／kg／d时，开始促进正常骨骼肌α-actin和MHCⅡa mRNA的表达，以及骨骼肌湿重的增加，同时提高了主动脉血管平滑肌α-actin的含量，增加了血管平滑肌的厚度。结论：骨骼肌失神经后内源性CT-1表达不足，是导致失神经骨骼肌早期萎缩的一个重要因素。而受体gp130／LIFR-β的表达上调，提高了肌肉对其配体CT-1的敏感性，及时应用外源性CT-1，可通过促进骨骼肌收缩性蛋白和保护性蛋白的合成、提高肌浆网Ca2+-ATPaSe的含量、抑制骨骼肌细胞的凋亡等途径对失神经骨骼肌产生营养和保护作用，有效地延缓失神经骨骼肌的萎缩，并改善神经再支配骨骼肌的功能，是一种很有前景的肌营养因子。在通过腹腔注射防治失神经骨骼肌萎缩时，CT-1的有效剂量是60μg／kg／d，最高安全剂量是100μg／kg／d。