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研究背景与目的:碳青霉烯类抗菌药物是一类抗菌谱广、抗菌作用强、不良反应发生率低的药物,但是随着这类药物的不当使用,使得耐药率随之上升,肠杆菌科细菌是目前对碳青霉烯类抗菌药物产生耐药的主要菌群。肠杆菌科细菌对碳青霉烯酶耐药机制主要分为三类:(1)膜通透性的改变;(2)药物作用靶点的改变;(3)产碳青霉烯酶。研究表明,产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌最主要的耐药机制。编码碳青霉烯酶的基因通常位于可移动的元件上,如质粒、整合子、插入序列等,易在细菌间横向传播,造成耐药菌的流行和爆发。碳青霉烯酶(Carbapenemase)可根据Ambler分类分为三类(A、B和D类),A类酶包括KPC、GES、SME等,B类酶包括IMP、NDM、VIM等,D类包括OXA-23、OXA-48等。虽然种类繁多,但全球范围内主要流行5种碳青霉烯酶:KPC(Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase)、NDM(New Delhi Metallo-lactamase)、VIM(Verona Integron-encoded Metallo-lactamase)、IMP(Imipenem-resistant Pseudomonas)、和 OXA-48(Oxacillin-hydrolysing carbapenemase)。产碳青霉烯酶肠杆菌的出现对人类的生命安全产生了重大的威胁。因此碳青霉烯酶的发现和早期识别非常重要。本研究拟建立多重降落PCR(Multiplex Touchdown PCR,MT-PCR)、基于核酸毛细管电泳的 MT-PCR(Capillary Electrophoresis based Multiplex Touchdown PCR,MT-PCR-CE)及侧流层析实验(Lateral Flow Assay,LFA)等方法,对5种常见碳青霉烯酶的编码基因(blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48)进行检测,为产碳青霉烯酶细菌感染的控制、预防和监测提供实验依据。研究方法:(1)挑选东部战区总医院保存的42株碳青霉烯类耐药菌株以及合成携带blaOXA-48部分基因序列的菌株,建立检测5种碳青霉烯酶基因的MT-PCR方法,分析其特异性、敏感性,检测限。并收集东部战区总医院临床微生物实验室2019年2月至3月送检的临床无菌体液标本67例及其分离菌株36例进行临床应用评价。(2)收集东部战区总医院保存的4例碳青霉烯类耐药菌株、1例合成的带有blaOXA-48部分基因菌株、1例不含碳青霉烯酶耐药基因的菌株,从NCBI数据库下载5种常见碳青霉烯酶基因不同的亚型序列,设计通用引物。用编码细菌16S rDNA的保守序列作为PCR反应的内参,建立一种MT-PCR-CE的方法,分析检测限。收集东部战区总医院45例临床耐药菌株,分析其特异性。(3)从NCBI数据库中下载blaIMP基因不同的亚型序列,设计出线性指数PCR(Linear After The Exponential PCR,LATE PCR)的引物和探针。摸索探针固定在侧流层析试纸条上的不同方法,优化探针固定条件和LFA(Lateral Flow Assay)反应条件,建立一种用于检测产碳青霉烯酶基因blaIMP的LFA技术。结果:(1)建立的MT-PCR技术可用于5种碳青霉烯酶基因的检测,对blaOXA-48、bla VIM和blaKPC检测限均为200 CFU/ml,而对blaIMP与blaNDM的检测限为2×103 CFU/ml。42株临床分离菌株的MT-PCR检测结果与单重PCR检测结果完全一致。以抗菌药物药敏试验为参考方法,67份无菌体液标本的MT-PCR结果与药敏试验结果呈高度一致性,差异无统计学意义(P=0.125),敏感性和特异性分别为80%和100%。(2)MT-PCR-CE的方法可用于5种碳青霉烯酶基因的检测。blaNDM,blaIMP的检测限为1.5×103 CFU/ml。blaOXA-48、bla VIM和blaKPC的检测限为1.5×103 CFU/ml。45例临床分离菌株的MT-PCR-CE检测结果与单重PCR的检测结果完全一致,特异性为100%。(3)建立一种检测blaIMP的LFA技术。Dig标记探针和抗Dig抗体交联后固定于LFA的硝酸纤维膜上,此方法较其它探针固定法好。在LFA的层析缓冲液中用0.07%酪蛋白封闭多余的抗Dig抗体。结论:(1)MT-PCR 可同时准确快速的检测blaIMP、bla VIM、blaNDM、blaKPC、blaOXA-48。与产碳青霉烯酶细菌的表型检测方法相比,其检测时间更短,特异性更高,检测限更低。(2)与普通PCR方法相比,MT-PCR-CE的检测更为特异,能分辨出仅相差7bp的片段。可用于5种碳青霉烯酶基因的快速检测。(3)建立的LFA技术可用于blaIMP的检测,在将来可在侧流层析试纸条上增加探针,检测多种碳青霉烯酶基因。