人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells，hESCs)能在体外培养条件下无限增殖并分化为三个胚层的细胞，因而被认为可能成为细胞/组织/器官移植的重要供体来源。此外，人胚胎干细胞同时也是研究人胚胎发育学的理想模型，较成体干细胞有更广阔的应用前景。目前大多数的hESCs是在小鼠胚胎成纤维细胞(MouSe Embryonic Fibroblast，MEF)上建系的。然而出于将来临床应用的需要，有必要去除动物源性物质的影响。因此科学家们进一步发展了人源饲养层或无饲养层的培养方法。但是，虽然对hESCs自我更新和分化机制的研究已经获得重要进展，但是在hESCs的临床应用成为现实前仍然有许多障碍： 1)hESCs扩增效率有待提高。与小鼠胚胎干细胞相比，hESCs增殖速度较慢，单细胞克隆性增殖的效率也较低，大约为1﹪。hESCs增殖速度慢则难于获得足够的细胞用于研究和临床应用，而较低的单细胞克隆性增殖的效率则使hESCs的基因修饰的应用尤为困难。 2)与其他细胞系和小鼠胚胎干细胞(MouseEmbryonic Stem Cells，mESCs)相比，转基因操作并达到在hESCs稳定基因修饰的工具是有限的，而基因修饰是细胞替代治疗所必需的。3)hESCs的移植与其它器官、组织或细胞移植技术一样存在hESCs与受者MHC匹配的要求，hESCs及其产物的替代治疗不可避免地面临移植免疫排斥问题。 前两者是相关的。为了筛选出稳定表达外源基因的hESCs，除了发展能高效进行转基因的工具，改善hESCs的培养条件提高hESCs克隆化生长效率从而有利于筛选低效率的稳定转基因的hESCs尤为重要。高效进行转基因是研究hESCs的重要工具，也是诱导hESCs的免疫耐受、解决免疫排斥问题的重要途径之经典的Wnt信号通路被认为与胚胎发育过程中细胞增殖、肿瘤或创伤后的组织再生以及其他很多生物过程有关，更被认为与干细胞的自我更新和分化有关。因此研究Wnt在hESCs增殖与分化方面的作用值得进一步探索。 T细胞活化是T细胞受体(T-cell Receptor，TCR)与抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cell，APC)的主要组织相容性抗原(madior histologiccomplexity，MHC)结合(信号1)和T细胞CD28与APC细胞的B7结合(信号2)共同作用的结果，缺乏信号2的共刺激信号可以引起T细胞的凋亡、无反应等从而引起免疫耐受。细胞毒性T淋巴细胞相关分子4(cytotoxic Tlymphocyte-associated molecule-4，CTLA4)也与B7结合，但起抑制信号作用。吲哚胺-2，3双氧化酶 (indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO)是色氨酸(Tryptophan)代谢通路的限速酶，而色氨酸是T细胞的必需氨基酸，色氨酸的不足同样可以引起T细胞的凋亡、无反应等从而引起免疫耐受。CTLA4和IDO诱导免疫耐受的作用在动物实验方面已经得到了证实，CTLA4与B7的结合还能促进APC细胞IDO的表达。细胞毒性T细胞相关分子4免疫球蛋白(cytotoxic T lymphocyte-associated molecule-4 immunoglobin，CTLA4Ig)是融合蛋白，能阻断CD28和B7的结合。CTLA4Ig、IDO非常适合作为诱导免疫耐受的靶基因。 为了研究免疫排斥/耐受必须进行体内实验和动物模型实验，因而需要发展敏感而又非侵入性的工具以监测移植细胞(比如hESCs及其分化产物)的动向。在过去的几年中已经发展了多种非侵入性的影像学技术。与其他的影像学技术如以HSV-tk为基础的影像学技术相比，荧光素酶为基础的影像学技术最具吸引力，因为它是非放射性的，而且存在比较少的与酶相关的免疫问题。 目的： 1)研究Wnt/catenin通路在hESCs自我更新和增殖中的作用，改善hESCs人源饲养层培养体系，以提高hESCs的扩增效率和克隆化生长的效率。 2)研究慢病毒载体对hESCs进行基因修饰的效率，观察慢病毒载体对hESCs多能性的影响。 3)发展无侵入的体内监测小鼠hESCs及其分化产物异种移植免疫反应动力学的影像学方法。 4)研究在免疫完全小鼠进行hESCs及其分化产物移植中CTLA-4 Ig和IDO诱导免疫耐受的可能。 方法： 1)应用细胞培养和逆转录病毒转导的方法，研究Wnt蛋白在hESCs自我更新和分化方面的作用。在永生化的人源饲养层细胞转导Wnt基因和三种抗生素抗性基因(Hygromycin，neomycin和puromycin)，即W3R细胞系。检测W3R支持未分化状态hESCs培养和筛选转染或转导后稳定整合目的基因的hESCs克隆可能。 2)用常规分子克隆技术构建能表达目的基因和药物抗性基因的慢病毒载体。测定其滴度并应用慢病毒颗粒转导hESCs。利用W3R饲养细胞进行筛选后，检测稳定整合目的基因的hESCs表达未分化标记物和它们向三个胚层分化的能力； 3)转导荧光素酶基因以利于细胞移植到活体后的影像学检查。通过系列稀释hESCs检测Xenogen检测系统的敏感性。移植到小鼠宿主体内后，仍然用相同的Xenogen检测系统监测所移植细胞的存在与增殖。 4)双重转导荧光素酶基因和CTLA4-Ig或IDO基因的hESCs移植于Balb/c来源的Rag<-/->γ<-/->小鼠做为阳性对照。Xenogen检测系统监测两组中移植细胞免疫排斥/耐受的细胞动力学。 结果： 1)Wnt蛋白能刺激hESCs的分化，在CM或bFGF存在的条件下则刺激增殖。同时通过基因修饰在永生化的人成纤维细胞过量表达Wnt蛋白和三种抗性基因，成功筛选转导或转染外源基因的hESCs。 2)应用慢病毒载体转导hESCs，能同时表达目的基因和药物抗性基因，能检测到目的基因的体外功能和蛋白表达。 3)两次转导后的hESCs仍然保持未分化状态和向三个胚层细胞分化的能力，细胞形态、克隆大小和外观以及生长速度等都没有明显变化。 4)体外Xenogen检测系统的荧光素信号敏感性是20，000hESCs细胞。 5)单纯过量表达CTLA4Ig或IDO的hESCs移植Balb/C小鼠经过7天信号消失，经过4周的观察仍未见荧光素信号重新出现。 结论： 1)在没有条件培养基或bFGF的条件下Wnt蛋白能促进分化，在添加这些组份后Wnt蛋白能促进hESCs的自我更新。 2)W3R饲养细胞能够支持未分化hESCs的生长并促进克隆形成。这一培养系统可用于筛选转染或转导后的hESCs3)慢病毒载体可以高效转导hESCs。利用两个启动子或IRES系统，用一个载体可以表达两种转基因。 4)转导后的hESCs可维持未分化状态并表达多能性标记物Oct-4 TRA-1-60、形成类胚胎体、分化为三个胚层的细胞。 5)通过在hESCs过量表达荧光素酶能实现非侵入性的活体影像学检查。hESCs细胞荧光素信号体外Xenogen检测系统的敏感性是20，000细胞。 6)转导CTLA4-Ig或IDO的hESCs与对照组细胞(transduced iDuet)在Rag<-/->在γc<-/->小鼠中的存活机率是一样的，但这两种基因在Balb/c小鼠中并没有显示出存活优势。