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蓖麻毒素(Ricin Toxin,RT)是从蓖麻籽中提取的一种天然植物源性蛋白毒素,属于Ⅱ型核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Proteins,RIPs)家族,对所有哺乳动物的真核细胞均具有极其强烈的细胞毒性。RT为高度糖基化修饰的二聚体蛋白,由RTA、RTB两条多肽链以二硫键共价连接形式构成。其中,RTA具有N-糖苷酶活性,能够作用于核糖体进而抑制蛋白质合成;RTB具有凝集素活性,能够与真核细胞表面糖蛋白和糖脂结合协助RTA进入细胞从而发挥毒性。RT的毒性作用存在剂量依赖性,高剂量RT的毒性主要表现为抑制蛋白质合成,低剂量RT可以诱导细胞凋亡、细胞膜损伤、膜结构和功能改变以及细胞炎性损伤。此外,根据机体暴露于RT的途径不同,其毒性强弱也存在差异。RT通过吸入途径进入机体的毒性最强,能够导致严重的肺损伤。RT进入肺部后与巨噬细胞表面的甘露糖受体结合,进而提升巨噬细胞的迁移速率。巨噬细胞是宿主抵御细菌感染和各种入侵病原微生物的第一道防线,在先天免疫和获得性免疫反应中发挥至关重要的作用。作为抗原递呈细胞,在激活过程中呈递抗原和释放细胞因子。Toll样受体(Toll-like Receptors,TLRs)参与先天免疫并发挥关键作用。TLRs在巨噬细胞表面高度表达,在配体诱导的刺激下,启动一系列细胞内信号传导进而导致促炎反应,能够作为纽带衔接着先天免疫反应和获得性免疫反应。TLR4信号转导通路是免疫细胞活化过程的关键环节,其介导的细胞炎症级联反应主要是My D88(myeloid differentiation factor 88)依赖途径和TRIF(TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β)依赖途径。针对RT触发先天免疫反应诱导炎性损伤信号转导机制的研究国内外报道甚少。本课题以RT为研究对象,利用分子生物学和CRISPR/Cas9基因编辑技术探讨了TLR4在RT诱导巨噬细胞炎性损伤中的关键作用,对于阐明RT诱导巨噬细胞炎性损伤的作用机制,寻找RT中毒救治的新途径和抗毒药物或疫苗的研发具有重要意义。本课题采用MTT方法检测了RT在体外对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞和人单核巨噬细胞系THP-1细胞存活率的影响。结果显示RT作用RAW264.7细胞的IC50约为36.14 ng/m L,RT作用THP-1细胞的IC50约为8.13 ng/m L。采用TLR4激活剂脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、TLR2激活剂肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)、TLR3激活剂聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)以及RT作用于RAW264.7和THP-1细胞,通过ELISA方法检测巨噬细胞炎症因子表达水平。结果表明,同LPS或PGN刺激相比,RT能够显著促进RAW264.7和THP-1细胞中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)的分泌,提示RT诱导细胞中TNF-α和IL-6分泌水平升高可能通过My D88依赖途径;同LPS或Poly I:C刺激相比,RT能够显著促进RAW264.7和THP-1细胞中干扰素-β(Interferon-β,IFN-β)的分泌,提示RT诱导细胞中IFN-β分泌水平升高可能通过TRIF依赖途径。采用Western Blot方法检测TLR4、My D88、TRIF、P-IκB-α和P-IRF3的蛋白表达水平,研究RT对TLR4介导的信号通路活化的影响。发现RT能够显著促进TLR4、My D88及TRIF的蛋白表达水平;当RT与LPS、PGN或Poly I:C共同作用时,能够显著上调P-IκB-α和P-IRF3的蛋白表达水平,表明RT可以通过激活TLR4信号级联中My D88依赖途径和TRIF依赖途径诱导巨噬细胞炎性损伤。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除My D88和TRIF基因的RAW264.7稳转细胞系。ELISA方法检测细胞炎症因子表达水平,发现稳定敲除My D88或TRIF基因的RAW264.7细胞中TNF-α和IFN-β的分泌水平显著降低,表明RT诱导巨噬细胞炎性损伤通过My D88依赖途径和TRIF依赖途径。采用免疫共沉淀技术检测RT与TLR4是否结合,研究RT激活TLR4的作用机制。结果表明,RT与TLR4存在蛋白质间相互作用。因此,TLR4可以作为RT的受体,通过蛋白质间相互作用激活TLR4信号通路。综上所述,本课题首次发现TLR4作为RT的受体,通过RT-TLR4蛋白质间相互作用激活下游My D88依赖途径和TRIF依赖途径介导细胞炎性损伤,揭示了低剂量RT激活TLR4信号通路的可能机制,将有助于在治疗RT引起的炎性损伤的过程中识别关键的靶分子,提高RT中毒的治疗效率,可以为研发抗RT药物或疫苗奠定理论基础。RT诱导巨噬细胞炎性损伤是否通过其他受体或信号转导途径,有待进一步探索研究。