论文部分内容阅读
神经母细胞瘤是目前15岁低幼儿童人群中常见的恶性度较高的实体肿瘤。据统计,由于肿瘤易发生转移,国内患儿的肿瘤切除率达不到50%,虽然新的化疗方案使患儿的生存率略有提高,但无病生存率仍在30%以下。寻找抗神经母细胞瘤新途径或低副作用的靶向治疗药物成为目前亟待解决的关键问题。谷胱甘肽过氧化物酶（glutaliiione peroxidases,GPXs）是体内广泛存在的一类过氧化物酶的统称,它可将细胞内过多的活性氧簇（ROS）还原成无毒化合物,并催化H2O2分解为水,从而降低过氧化物对细胞的氧化性损伤。GPX4是此酶系中最重要的亚单位,分布于细胞内各种膜结构上,清除各种脂质过氧化物。最近的研究发现,下调GPX4表达可以通过诱导肿瘤细胞发生ferroptosis提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。Ferroptosis是新近发现的铁依赖的程序性细胞死亡方式,与凋亡有明显区别。小分子化合物erastin是ferroptosis激活剂,通过下调GPX4导致细胞内脂质过氧化物蓄积引起细胞死亡,并且此过程被ferroptosis抑制剂阻断时,但不影响化疗药物引起的肿瘤细胞凋亡。目前多数化疗药物仍是通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,但肿瘤细胞会随着用药时间的延长而产生耐药。Ferroptosis的发现为抗肿瘤途径的深入研究提供新的方向。顺铂是抗癌谱广、作用强的非周期性抗肿瘤药,与多种化疗药物联合应用不发生交叉耐药,一直作为小儿神经母细胞瘤联合化疗方案中的一线化疗药物。研究发现,顺铂可诱导人结肠癌细胞和非小细胞肺癌细胞发生ferroptosis。Ferroportin（Fpn）是细胞中唯一的铁输出蛋白,在铁的跨膜输出中起着不可或缺的作用,调节铁的内稳态。Fpn表达的改变可能导致铁缺乏或铁超载[4-6]。细胞内铁的积累与Fpn的缺乏相关,并且通过增加Feton反应产生的脂质ROS来促进ferroptosis的发生。研究发现,和GPX4一样,Fpn也是是肿瘤的独立危险因素,与肿瘤远处转移患者生存率的降低有关。先前的研究已经表明Fpn在癌细胞中的表达升高。然而,Fpn在由erastin诱导的神经母细胞瘤细胞的ferroptosis中的潜在作用还有待探索。下调Fpn能否与下调GPX4发挥协同抗肿瘤作用尚不清楚。小儿神经母细胞瘤组织中是否存在GPX4的表达,下调GPX4是否引起人神经母细胞瘤细胞株死亡,且通过何种死亡方式发挥作用,对肿瘤细胞的顺铂敏感性有何影响,以上问题尚无相关阐述。因此,本研究拟通过体外实验探讨GPX4在人神经母细胞瘤组织与细胞株中的表达,研究应用RNA干扰技术沉默GPX4基因后对人神经母细胞瘤细胞增殖的影响及机制,同时研究下调GPX4是否对细胞的顺铂敏感性产生影响,并通过体外试验研究ferroptosis诱导剂与顺铂联合应用能否通过下调GPX4提高抗瘤活性,并进一步探讨Fpn在调节GPX4抑制剂erastin诱导神经母细胞瘤细胞死亡中的作用,以期为小儿神经母细胞瘤的治疗提供新的靶向。第一部分GPX4在人神经母细胞瘤组织与细胞中的表达目的:观察小儿神经母细胞瘤组织和人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株细胞中GPX4基因与蛋白的表达情况,探讨神经母细胞瘤细胞是否可以成为诱导肿瘤细胞发生ferroptosis的靶点。方法:收集我院小儿神经母细胞瘤患者临床标本42例,用于制作石蜡切片;同时常规培养人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株。RT-qPCR法检测组织与细胞中GPX4基因的表达情况;免疫组织化学、免疫细胞化学和Western blot检测组织与细胞中GPX4蛋白的表达情况。结果:1.免疫组织化学检测结果显示,在42例神经母细胞瘤组织标本中,有39例标本肿瘤组织中肿瘤细胞的胞质内充满棕黄色颗粒即为GPX4阳性表达,阳性表达率为92.86%,25例标本的癌旁组织中也可见GPX4呈微弱阳性表达,阳性表达率为59.52%。2.免疫细胞化学结果显示,GPX4主要在SK-N-SH细胞的胞质中表达,图中棕黄色颗粒为阳性表达。3.Western Blot结果显示,42例神经母细胞瘤组织中均检测到GPX4蛋白的表达,而癌旁组织中有19例未检测到GPX4蛋白的表达,23例癌旁组织中呈低表达,相对于内参β-actin的表达量明显低于肿瘤组织的相对表达量,差异有统计学意义（P<0.01）;SK-N-SH细胞中也检测到GPX4目的条带的表达。4.RT-qPCR结果显示,42例神经母细胞瘤组织中均检测到GPX4mRNA的表达,而癌旁组织中有13例未检测到GPX4 mRNA的表达,29例癌旁组织中GPX4 mRNA呈低表达,明显低于肿瘤组织的相对表达量,差异有统计学意义（P<0.01）,SK-N-SH细胞中也检测到GPX4 mRNA的表达。小结:1.GPX4 mRNA与蛋白在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株与小儿神经母细胞瘤组织中均有表达。2.GPX4 mRNA与蛋白在小儿神经母细胞瘤组织中的表达均明显高于癌周正常组织。第二部分下调GPX4对人神经母细胞瘤细胞增殖的影响及其机制目的:从细胞的增殖与凋亡变化、细胞内脂质过氧化水平、细胞内铁离子含量等形态学与分子生物学水平,探讨下调GPX4基因对神经母细胞瘤细胞株增殖的影响及其可能机制。方法:将SK-N-SH细胞随机分为7组,⑴空白对照组:只加转染试剂;⑵阴性对照组:转染试剂和control siRNA-A;⑶无关对照组:未加siRNA和转染试剂;⑷阳性对照组:转染试剂和β-actin siRNA;⑸实验组:6.25 nM、12.5 nM和25 nM GPX4 siRNA转染组。分别于干扰24、48和72h后收集细胞,提取RNA和蛋白。RT-qPCR检测干扰后各组细胞中GPX4 mRNA的表达情况;Western blot检测转染前后各组细胞中GPX4蛋白的表达;倒置荧光显微镜观察确定后续实验用GPX4 siRNA的有效转染浓度;MTT法检测各组细胞的增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;TUNEL检测各组细胞的凋亡情况;流式细胞术检测各组细胞中ROS水平;生化法检测各组细胞丙二醛、谷胱甘肽、铁离子、GPXs活性;透射电镜观察细胞中线粒体结构变化。结果:1.GPX4 siRNA干扰效能的评价:⑴荧光实时定量PCR检测结果显示:无关对照组、空白对照组、阳性对照组和阴性对照组细胞中GPX4mRNA的表达未见明显改变;实验A组细胞用6.25 nM GPX4 siRNA干扰48和72 h后GPX4mRNA的表达低于无关对照组、空白对照组、阳性对照组和阴性对照组,但无显著差异（P>0.05）;实验B组用12.5 nM GPX4siRNA干扰24、48和72h后GPX4mRNA的表达明显低于无关对照组、空白对照组、阳性对照组和阴性对照组,实验C组用25 nM GPX4 siRNA干扰24、48和72h后GPX4mRNA的表达明显低于无关对照组、空白对照组、阳性对照组和阴性对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;实验B组干扰48 h后GPX4mRNA的表达明显低于干扰72 h后,差异有统计学意义（P<0.05）;实验C组干扰48 h后GPX4mRNA的表达明显低于干扰72 h后,差异有统计学意义（P<0.05）;实验B组干扰48 h后GPX4mRNA的表达高于实验C组干扰48 h后,差异无统计学意义（P>0.05）。⑵Western blot检测结果显示:无关对照组、空白对照组、阳性对照组和阴性对照组细胞在干扰24、48和72 h后GPX4蛋白的表达无明显变化（P>0.05）;实验A、B、C组细胞在干扰48和72 h后GPX4蛋白的表达均明显低于无关对照组、空白对照组、阳性对照组和阴性对照组,干扰72 h后细胞GPX4蛋白表达明显低于干扰48 h后,差异有统计学意义（P<0.05）;实验B组干扰48 h后GPX4蛋白表达明显低于实验A组干扰48和72 h后（P<0.05）;实验B组干扰72 h后GPX4蛋白表达低于干扰48后,但差异无统计学意义（P>0.05）;实验C组干扰72 h后GPX4蛋白表达明显低于实验B组干扰48 h和72 h后（P<0.05）;实验C组干扰72 h后GPX4蛋白表达明显低于干扰48 h后,差异有统计学意义（P<0.05）。2.MTT检测结果显示:转染试剂对细胞的存活率无明显影响;转染GPX4 siRNA下调GPX4后,细胞存活率明显降低,实验组细胞存活率明显低于无关对照组和阴性对照组（P<0.01）。3.流式细胞术检测结果显示:转染试剂对细胞凋亡无明显影响;转染GPX4 siRNA下调GPX4后,细胞凋亡率明显升高,实验组细胞凋亡率明显高于无关对照组和阴性对照组（P<0.05）。4.TUNEL检测结果显示:转染GPX4 siRNA下调GPX4后,细胞凋亡数明显增加,实验组细胞凋亡数明显高于无关对照组和阴性对照组（P<0.05）。5.流式细胞术检测结果显示:转染试剂对细胞内ROS水平无明显影响;转染GPX4 siRNA下调GPX4后,细胞内ROS水平明显升高,实验组细胞内ROS水平明显高于无关对照组和阴性对照组（P<0.05）。6.转染试剂对细胞内GSH含量和GPXs活性无明显影响;转染GPX4siRNA下调GPX4后,细胞内GSH含量明显降低,实验组细胞内GSH含量明显低于无关对照组和阴性对照组（P<0.05）;细胞内GPXs活性明显降低,实验组细胞内GPXs活性明显低于无关对照组和阴性对照组（P<0.05）。7.转染试剂对细胞内MDA含量无明显影响;转染GPX4 siRNA下调GPX4后,细胞内MDA含量明显升高,实验组细胞内MDA含量明显高于无关对照组和阴性对照组（P<0.05）。8.转染试剂对细胞内铁含量无明显影响;转染GPX4 siRNA下调GPX4后,细胞内铁含量无明显变化,实验组细胞内铁含量与无关对照组和阴性对照组无明显差异（P>0.05）。9.转染试剂对细胞内线粒体形态无明显影响;转染GPX4 siRNA下调GPX4后,细胞内线粒体明显变小,线粒体膜增厚、电子密度增高。小结:1.下调GPX4使SK-N-SH细胞的存活率降低、凋亡率上升。2.下调GPX4可降低SK-N-SH细胞内的GSH含量、提高细胞内ROS和脂质过氧化水平、降低GPXs活性和改变细胞内线粒体的形态。第三部分下调GPX4通过ferroptosis提高人神经母细胞瘤对顺铂的敏感性目的:首先观察下调GPX4诱导SK-N-SH细胞死亡的可能方式;随后应用顺铂干预细胞观察细胞对顺铂的敏感性的变化;最后将GPX4抑制剂与顺铂联合应用,观察协同抗肿瘤的作用,探讨下调GPX4能否提高SK-N-SH细胞对顺铂的敏感性。方法:分别应用ferroptosis抑制剂、凋亡抑制剂、坏死抑制剂、自噬抑制剂处理SK-N-SH细胞,48 h后收集细胞,进行后续实验。按照处理方式和检测目的不同将细胞分别分组:⑴control组、vehicle组、z-vad-fmk组、Fer-1组、Necrostatin-1组、3-MA组;⑵control组、vehicle组、顺铂组、顺铂+siRNA组;⑶control组、vehicle组、顺铂组、Erastin组、顺铂+Erastin组。MTT法检测各组细胞的增殖活性;试剂盒法检测细胞死亡率;生化法检测各组细胞内脂质过氧化水平、谷胱甘肽水平、铁离子含量和GPXs活性。结果:1.下调GPX4诱导SK-N-SH细胞死亡的方式:⑴MTT法检测结果显示:与control组相比,vehicle组、z-vad-fmk组、Fer-1组、Necrostatin-1组和3-MA组细胞增殖率明显降低（P<0.05）;与vehicle组相比,Fer-1组细胞增殖率明显升高（P<0.05）,Necrostatin-1组和3-MA组细胞增殖率无明显差异（P>0.05）。⑵Caspase-3活性检测结果显示:与control组比较,vehicle组、z-vad-fmk组、Fer-1组、Necrostatin-1组和3-MA组细胞Caspase-3活性明显升高（P<0.05）;与vehicle组相比,z-vad-fmk组细胞Caspase-3活性明显降低（P<0.05）,Fer-1组、Necrostatin-1组和3-MA组细胞Caspase-3活性无明显差异（P>0.05）;与z-vad-fmk组相比,Fer-1组细胞Caspase-3活性明显降低（P<0.05）。⑶细胞脂质过氧化水平检测结果显示:与control组比较,vehicle组、z-vad-fmk组和Fer-1组细胞脂质过氧化水平明显升高（P<0.05）;与vehicle组相比,z-vad-fmk组细胞脂质过氧化水平无明显差异（P>0.05）,Fer-1组细胞脂质过氧化水平明显降低（P<0.05）;与z-vad-fmk组相比,Fer-1组细胞脂质过氧化水平明显降低（P<0.05）。⑷细胞铁含量检测结果显示:与control组比较,vehicle组和z-vad-fmk组细胞铁含量无明显差异（P>0.05）;与vehicle组相比,z-vad-fmk组细胞铁含量无明显差异（P>0.05）,Fer-1组细胞铁含量明显降低（P<0.05）;与z-vad-fmk组相比,Fer-1组细胞铁含量明显降低（P<0.05）。2.下调GPX4对SK-N-SH细胞顺铂敏感性的影响:⑴细胞死亡率检测结果显示:与control组相比,顺铂组和顺铂+siRNA组细胞死亡率明显升高（P<0.05）;与vehicle组相比,顺铂组和顺铂+siRNA组细胞死亡率明显升高（P<0.05）;与顺铂组相比,顺铂+siRNA组细胞死亡率明显升高（P<0.05）。⑵细胞脂质过氧化水平检测结果显示:与control组相比,顺铂组和顺铂+siRNA组细胞脂质过氧化水平明显升高（P<0.05）;与vehicle组相比,顺铂组和顺铂+siRNA组细胞脂质过氧化水平明显升高（P<0.05）;与顺铂组相比,顺铂+siRNA组细胞脂质过氧化水平明显升高（P<0.05）。⑶细胞GSH含量检测结果显示:与control组相比,顺铂组和顺铂+siRNA组细胞GSH含量明显降低（P<0.05）;与vehicle组相比,顺铂组和顺铂+siRNA组细胞GSH含量明显降低（P<0.05）;与顺铂组相比,顺铂+siRNA组细胞GSH含量明显降低（P<0.05）。⑷细胞GPXs活性检测结果显示:与control组相比,顺铂组和顺铂+siRNA组细胞GPXs活性明显降低（P<0.05）;与vehicle组相比,顺铂组和顺铂+siRNA组细胞GPXs活性明显降低（P<0.05）;与顺铂组相比,顺铂+siRNA组细胞GPXs活性明显降低（P<0.05）。3.Erastin对SK-N-SH细胞顺铂敏感性的影响:⑴细胞死亡率检测结果显示:与control组相比,顺铂组、Erastin组和顺铂+Erastin组细胞死亡率明显升高（P<0.05）;与vehicle组相比,顺铂组、Erastin组和顺铂+Erastin组细胞死亡率明显升高（P<0.05）;与顺铂组相比,顺铂+Erastin组细胞死亡率明显升高（P<0.05）;与Erastin组相比,顺铂+Erastin组细胞死亡率明显升高（P<0.05）。⑵细胞脂质过氧化水平检测结果显示:与control组相比,顺铂组、Erastin组和顺铂+Erastin组细胞脂质过氧化水平明显升高（P<0.05）;与vehicle组相比,顺铂组、Erastin组和顺铂+Erastin组细胞脂质过氧化水平明显升高（P<0.05）;与顺铂组相比,顺铂+Erastin组细胞脂质过氧化水平明显升高（P<0.05）;与Erastin组相比,顺铂+Erastin组细胞脂质过氧化水平明显升高（P<0.05）。⑶细胞GSH含量检测结果显示:与control组相比,顺铂组、Erastin组和顺铂+Erastin组细胞GSH含量明显降低（P<0.05）;与vehicle组相比,顺铂组、Erastin组和顺铂+Erastin组细胞GSH含量明显降低（P<0.05）;与顺铂组相比,顺铂+Erastin组细胞GSH含量明显降低（P<0.05）;与Erastin组相比,顺铂+Erastin组细胞GSH含量明显降低（P<0.05）。⑷细胞GPXs活性检测结果显示:与control组相比,顺铂组、Erastin组和顺铂+Erastin组细胞GPXs活性明显降低（P<0.05）;与vehicle组相比,顺铂组、Erastin组和顺铂+Erastin组细胞GPXs活性明显降低（P<0.05）;与顺铂组相比,顺铂+Erastin组细胞GPXs活性明显降低（P<0.05）;与Erastin组相比,顺铂+Erastin组细胞GPXs活性明显降低（P<0.05）。小结:1.下调GPX4可以诱导SK-N-SH细胞发生ferroptosis。2.下调GPX4可以提高SK-N-SH细胞对顺铂的敏感性。3.GPX4抑制剂与顺铂联合应用可提高SK-N-SH细胞对顺铂的敏感性。第四部分下调ferroportin可提高人神经母细胞瘤对erastin的敏感性目的:观察Fpn在调节GPX4抑制剂erastin诱导神经母细胞瘤细胞死亡中的作用,探讨下调Fpn能否与下调GPX4发挥协同抗肿瘤作用。方法:1.用20μM erastin处理SK-N-SH细胞6、12、24 h后,实时荧光定量PCR检测各时间点细胞中Fpn mRNA的表达;Western blot检测各时间点细胞中Fpn蛋白的表达;用20μM erastin分别与ferrostatin-1、DFO、NAC、Z-VAD-FMK、Necrostatin-1和3-Methyladenine共同处理SK-N-SH细胞12 h后,用实时荧光定量PCR检测各组细胞中Fpn mRNA的表达。2.按干预方法不同,将细胞分为3组:control组、erastin组、control siRNA组、ferroportin 1 siRNA组,培养24 h后用实时荧光定量PCR检测各组细胞中Fpn mRNA的表达;试剂盒检测细胞死亡率、细胞铁含量、脂质过氧化水平;用ferroportin 1 siRNA+erastin分别与ferrostatin-1、DFO、NAC、Z-VAD-FMK、Necrostatin-1和3-Methyladenine共同处理SK-N-SH细胞24 h后,检测细胞死亡率;按干预方法将细胞分为3组:control组、erastin组、erastin+ponasterone组,培养24 h后Western blot检测各组细胞中Fpn蛋白的表达。3.按干预方法将细胞分为4组:erastin组、erastin+ponasterone组、erastin+ponasterone+ferroportin 1 siRNA组、Fpn cDNA组,培养24 h后检测细胞死亡率、细胞铁含量;按干预方法将细胞分为3组:control组、erastin组、erastin+Hepcidin组,培养24 h后检测细胞死亡率。结果:1.Erastin对SK-N-SH细胞中Fpn表达的影响:用erastin（20μM）处理SH-SY5Y细胞后,Fpn mRNA在6 h开始下降,12 h后显著下降（P<0.05）;Fpn蛋白在12 h后开始下降,24 h后下降明显（P<0.05）;此外,erasin以时间依赖的方式降低了Fpn的mRNA和蛋白水平（P<0.05）;ferrostatin-1、DFO和NAC则上调Fpn的表达（P<0.05）;然而,Fpn的水平不受Z-VAD-FMK、Necrostatin-1和3-Methyladenine的调节（P>0.05）。2.下调Fpn对SK-N-SH细胞erastin敏感性的影响:用ferroportin 1siRNA或对照siRNA转染SH-SY5Y细胞,与erastin共孵育12 h,转染ferroportin 1 siRNA可有效降低Fpn mRNA的水平（P<0.05）;Fpn的下调使SH-SY5Y细胞中erastin诱导的生长抑制增强（P<0.05）;下调Fpn同样增加了erasin诱导的细胞内铁含量和脂质过氧化水平（P<0.05）;此外,与只用erastin处理的细胞相比,ferrostatin-1、DFO和NAC处理则显著提高了细胞的活力（P<0.05）,而Z-VAD-FMK、Necrostatin-1和3-Methyladenine处理的细胞没有影响细胞活力（P>0.05）。3.上调Fpn对SK-N-SH细胞erastin敏感性的影响:用ponasterone（10μM）孵育24 h后,Fpn的蛋白水平显著升高（P<0.05）;Fpn诱导剂ponasterone,降低了erastin诱导的细胞生长抑制作用和细胞内铁含量（P<0.05）;相反,FPN siRNA下调Fpn逆转了ponasterone的作用（P<0.05）;同时,通过转染Fpn cDNA上调Fpn后也显著降低erastin诱导的细胞生长抑制和铁含量（P<0.05）;Hepcidin促进了erastin诱导的ferroptosis（P<0.05）。小结:1.下调Fpn可以诱导SK-N-SH细胞发生ferroptosis。2.下调Fpn可以提高SK-N-SH细胞对erastin的敏感性。结论:1.人神经母细胞瘤组织与细胞中均有GPX4的表达2.下调GPX4可诱导SK-N-SH细胞发生凋亡和ferroptosis。3.下调GPX4通过提高SK-N-SH细胞内脂质过氧化水平和降低GSH含量诱导细胞发生ferroptosis。4.下调GPX4可以提高SK-N-SH细胞对顺铂的敏感性。5.GPX4抑制剂与顺铂联合应用可提高SK-N-SH细胞对顺铂的敏感性。6.下调Fpn可以诱导SK-N-SH细胞发生ferroptosis。7.下调Fpn可以提高SK-N-SH细胞对erastin的敏感性。