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目的:圆锥角膜（Keratoconus,KC）是一种进行性的角膜中央变薄且呈锥形突出的疾病,是青少年最常见的致盲性眼病,也是我国和美国第四位角膜移植手术的适应证。目前对圆锥角膜的发病机制不清楚,因此临床上对圆锥角膜无药物干预治疗的措施,发展到晚期只能接受角膜移植手术。因此,深入阐明KC相关发病机制对于临床防治至关重要。目前有关KC的发病机制的研究主要涉及炎症、氧化应激、生物力学等方面,但其确切发病机制尚未完全明确。N6-甲基腺嘌呤（N6-Methyladenosine,m~6A）是真核细胞中RNA最丰富的表观遗传修饰之一,在参与调控RNA剪接、表达、衰变、翻译、稳定性等方面发挥关键作用。大量研究表明,m~6A修饰与多种生理、病理状态密切相关,预实验研究提示其在KC的发病过程可能发挥重要作用。因此,本研究旨在探讨m~6A修饰是否在KC发生发展过程中发挥潜在作用。方法:1.实验材料的收集收集11例（11只眼）在山东第一医科大学附属眼科医院进行角膜移植的KC患者完成期的圆锥角膜作为实验组,11例眼库捐献者的正常角膜作为对照组。其中6对用于检测m~6A修饰相关蛋白表达,5对用于m~6A芯片分析。2.m~6A修饰关键蛋白水平的检测利用Western blot方法检测6例KC患者和6例正常角膜中m~6A修饰相关蛋白的表达情况。m~6A修饰蛋白主要包括Wilms肿瘤相关蛋白（Wilms tumor-associated proteins,WTAP）、甲基转移酶样3（methyltransferase-like 3,METTL3）、甲基转移酶样14（methyltransferase-like 14,METTL14）,脂肪质量和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-related proteins,FTO）,Alk B同系物5(（Alk B Homolog 5,ALKBH5）,YTH domain family（YTHDF2）。3.RNA提取与m~6A修饰芯片分析用TRIzol法对收集的样本提取RNA,并进行m~6A-m RNA表观转录组学微阵列分析,以构建正常和KC中的m~6A修饰图谱。由此获得m RNA上m~6A修饰的数据。4.m~6A修饰差异基因的生物信息学功能分析通过设置m~6A修饰标准阈值（Fold change≥2,P-value≤0.05）,选取符合标准的m~6A修饰差异的基因分别进行功能富集分析,GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析。通过上述分析初步明确m~6A修饰差异基因在KC发生发展过程中的作用。5.差异基因的Me RIP-q PCR验证为明确m~6A芯片数据的可靠性,我们随机筛选出候选差异基因并结合RNA-蛋白免疫共沉淀和实时荧光定量PCR（Me RIP-q PCR）对以上筛选出的候选差异基因进行验证。结果:1 KC组织中m~6A修饰相关蛋白存在明显差异表达通过Western blot结果显示:与对照组相比,在KC组中,m~6A阅读蛋白（Reader）YTHDF2、m~6A去甲基化酶（Eraser）FTO以及甲基化转移酶（methyltransferase,也叫Writer）WTAP蛋白表达水平显著降低。而甲基转移酶METTL3和METTL14的蛋白表达量没有显著变化。以上结果表明,KC组织中存在m~6A修饰相关蛋白表达异常,提示m~6A修饰可能参与KC的发病过程。2 RNA质控利用Trizol法提取组织RNA后,分别采取OD260/280比值1.8-2.1,OD260/230比值1.8-2.1,来判定RNA质控结果。检测结果显示,RNA均通过质量控制标准,为后续进行m~6A-m RNA表观转录组学微阵列分析奠定基础。3 KC中m~6A修饰差异表达基因（Differentially expressed gene,DEGs）的概述分层聚类分析显示:实验组与对照组间的m RNA表达模式存在显著差异。通过m~6A芯片共鉴定出17297个转录本,其中存在m~6A差异表达的基因有366个（Fold change≥2,P-value≤0.05）:高甲基化的有287个,低甲基化的有79个。通过四象限图进一步发现,高甲基化并且m RNA水平上调的有527个,低甲基化并且m RNA水平下调的有241个,高甲基化但m RNA水平下调的有49个。4 KC中m~6A修饰差异基因的生物学功能分析我们对366个差异甲基化基因对应的817个转录本（|log2FC|≥2）进行了生物信息学功能分析。通过GO功能分析发现:高甲基化修饰基因参与的生物过程（Biological Process,BP）主要有:心脏收缩力的调节、动作电位的正向调节、ATP酶活性的正向调节、蛋白定位到微管组织中心和横纹肌收缩的正向调节等,提示生物力学可能参与KC的发病过程;而低甲基化修饰基因富集的BP主要包括:RNA聚合酶II转录的pri-mi RNA,主动脉发育等。KEGG分析发现:高m~6A修饰基因主要参与卟啉和叶绿素代谢、流体剪切应力和动脉粥样硬化、VEGF信号通路以及c GMP-PKG信号通路等;而低m~6A修饰基因主要参与神经活性配体-受体相互作用、谷氨酸突触等信号通路。5 Me RIP-q PCR验证候选m~6A修饰基因通过Me RIP-q PCR对候选基因进行验证,其中组织蛋白酶B（Cathepsin B,CTSB）、ATP依赖性Lon蛋白酶（Cereblon,CRBN）、锌指蛋白ZBTB38、亮氨酸受体蛋白（SAR1B）、含有16A的脱水解酶结构域（Abhydrolase Domain Containing 16A,ABHD16A）和酰基辅酶A结合结构域蛋白4（Acyl-Co A Binding Domain Containing 4,ACBD4）的甲基化水平升高,其对应的m RNA水平也显著升高;HMG-Co A还原酶（3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Co A Reductase,HMGCR）、ADAM金属肽酶与血栓消退素1型基序6（ADAM Metallopeptidase With Thrombospondin Type 1 Motif 6,ADAMTS6）和DLG相关蛋白1（DLG associated protein 1,DLGAP1）在KC中甲基化水平及m RNA转录水平均明显降低。通过上述实验发现候选基因的转录水平和m~6A修饰水平的变化趋势与m~6A芯片的结果均一致,进一步证实了m~6A芯片数据的可靠性。结论:上述系列研究表明,KC中存在m~6A修饰相关蛋白表达水平的失衡;通过m~6A-m RNA表观转录组芯片共鉴定出366个存在明显m~6A修饰差异的基因,并且在功能上与生物力学、神经调控以及mi RNA的转录等有关,为后续研究KC的发病机制提供了可供选择的线索。