论文部分内容阅读
本研究对已经构建好的重组质粒pPNS1通过EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ双酶切后,亚克隆进原核表达载体PET30a（+）中,构建了一株重组表达质粒PET-NS1;对PET-NS1进行酶切、菌落PCR、光生物素标记分子杂交以及测序分析鉴定,表明该重组表达质粒构建确实可靠:将其转入表达宿主菌BL21中,通过IPTG的诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明重组NS1蛋白得以高效表达,以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的26.7%。并确定了NS1蛋白的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.6mM,诱导时间为3h。Western-Blot鉴定NS1蛋白分子量约86.0KD,具有抗原性。 大量表达的重组蛋白经纯化后作为抗原,包被酶标板,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗,建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验（PPA-NS1-ELISA）检测方法。经检测抗原最佳包被浓度为33ug/ml,血清最佳稀释度为1:40,阳性标准初步确定为:OD490待检血清>0.30。与猪乙型脑炎病毒、猪瘟、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒的阳性血清呈阴性反应,与猪细小病毒阳性血清呈阳性反应,与本实验室研究的猪伪狂犬病毒重组猪细小病毒二价疫苗免疫猪血清呈阴性反应,与猪细小病毒灭活疫苗免疫猪血清呈阴性反应。检测结果隔周重复检测3次,重复性良好。实验结果表明该方法具有经济、特异性强、灵敏度高的特点,能较好的区分PPV自然感染猪和灭活疫苗免疫猪。