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我室前期的工作证明热刺激之后小麦胚芽鞘表皮细胞内的钙离子浓度明显升高,热激还促进钙调素（CaM）基因的表达和CaM蛋白在细胞中的积累,并且钙、钙调素可明显影响热激转录因子（HSF）与热激元件（HSE）的结合活性、热激基因的表达、热激蛋白的积累以及作物耐热性。在模式植物拟南芥中:热激能引起细胞内钙离子浓度和CaM基因表达的明显上升;并且Ca2+和CaM可明显提高热激蛋白的表达水平。拟南芥中不同亚型的CaM对热激的响应研究表明,热刺激之后AtCaM3和AtCaM7的表达有明显升高,而且AtCaM3的表达先于AtCaM7和HSP18.2,这一结果暗示AtCaM3很有可能参与了热激信号转导。最近的研究结果表明:钙调素结合的蛋白激酶AtCBK3是热激信号由CaM传递到HSF的重要一环:in vivo和in vitro的证据证明AtCBK3和AtHSFA1之间的相互作用;CaM激活的AtCBK3可以使AtHSFA1发生磷酸化;AtCBK3的缺失突变体株系、过表达株系分别表现为植物耐热性的缺陷和提高。另一方面在拟南芥中,钙调素结合的蛋白磷酸酶AtPP7也有可能参与了热激信号由CaM到HSF的转导过程:in vitro实验表明AtPP7与CaM及HSF均可以结合;AtPP7的缺失突变体表现为其耐热性下降,然而过表达AtPP7后则可以明显提高转基因植株的耐热性。以上实验结果显示AtCBK3、AtPP7均是热激信号转导途径中CaM下游的重要成员。根据我室多个层次不同水平的研究结果表明钙-钙调素参与了热激信号转导,我们认为在植物细胞内存在一条新的热激信号转导途径:钙-钙调素途径,并提出了Ca2+、CaM参与的热激信号转导途径中上、下游关系的模式图:热激被细胞表面某种受体感受,引起胞内Ca2+浓度升高,Ca2+激活CaM并促进CaM基因的表达,活化的Ca2+-CaM可以与AtCBK3、AtPP7发生相互作用并使之活化,活化的AtCBK3、AtPP7可以通过磷酸化或去磷酸化作用调节HSF的活化状态进而调控热激基因的表达。通过我们的研究,热激信号转导的中、下游的组分及作用机制比较清晰了,那么热激反应的原初反应是如何进行的呢?即热信号是通过什么机制使植物细胞内钙离子浓度升高的呢?根据预备实验结果,我们推测有两种可能的途径:一热激引起的胞内钙库动员,二热激引起的胞外钙库的动员。本研究论文的研究工作即围绕着这两条可能通路而展开。一方面,本论文研究结果发现:在植株受到热刺激之后,拟南芥细胞内的三磷酸肌醇（IP3）的含量有明显的升高,且这个过程非常迅速,大约在五分钟内完成;利用水母发光蛋白测钙法确定了三磷酸肌醇-磷脂酶C（IP3-PLC）信号系统与热激引起的Ca2+升高之间的关系,结果表明IP3-PLC部分的介导了热激引起的胞内Ca2+升高的过程;接下来含有AtHSP18.2 promoter::GUS融合基因的转基因拟南芥被用于检测IP3、PLC活性的抑制剂U73122与热激蛋白积累之间的关系,结果表明IP3在非热激条件下可以促进HSP18.2的表达,这证明IP3-PLC参与了热激蛋白的积累过程。为了进一步了解IP3-PLC在热激信号转导中的作用,通过realtime PCR的方法检测了拟南芥基因组中PLC六个亚型在热激后的表达情况,发现PLCa、PLCb在热激后mRNA含量变化最为明显;通过构建35S::C2（PLCb）-YFP-PAVA321瞬时表达载体转化洋葱表皮观察C2结构域的定位情况,在正常生长条件YFP的荧光大多分布于细胞的质之中,而在热激处理后YFP的荧光定位发生了明显的变化,这暗示热激处理可以使C2结构域发生功能性的定位转移,这为PLCs参与热激信号转导过程提供了更为有力的证据。另一方面,本论文从研究细胞膜钙离子通道入手,采用了膜片钳技术对细胞膜上钙离子通道进行电生理的研究。以拟南芥根组织的伸长区的表皮层细胞为材料制备原生质体,采用全细胞模式记录基本电流,检测到了跨膜的钙电流,并检测到在根原生质体质膜上存在超极化激活的电压依赖性的钙通道。通过对热处理前后质膜跨膜电流的记录,我们发现在热激后质膜跨膜电流在-200mV下的电流强度较热激处理前增大2倍以上,这证明了热激后质膜上钙通道活性是明显提高的,暗示根原生质体质膜钙通道参与了热激引起的胞内钙升高的过程。为了进一步研究质膜钙通道参与了热激引起的胞内钙升高过程中的关键基因,我们从拟南芥突变体库中得到了感兴趣的基因的T-DNA插入缺失突变体,并对其进行耐热性的分析,结果发现:有一基因（AtCNGCx）的T-DNA插入缺失突变体表现为比较明显耐热性下降现象,该基因为环核苷酸门控通道（CNGC）家族之中的一个成员。膜片钳的结果显示,在热激条件下,cngcx-1突变体（AtCNGCx转录本完全缺失）没有表现出和野生型类似的电流明显变大的现象,而cngcx-2突变体（存在部分的AtCNGCx转录本）与野生型的表现相似。这表明在AtCNGCx完全缺失之后,细胞受到热激后细胞质膜跨膜电流升高的现象消失,暗示AtCNGCx可能是负责热激后产生钙信号的重要基因。通过以上两方面的实验的结果表明:无论是PLCs介导的胞内钙库的释放,还是质膜CNGCs介导的胞外钙库的释放,均可能参与了热激引起的钙原初反应的过程。