【摘 要】
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目的建立永生化SD大鼠胰岛细胞系。方法采用预冷的胶原酶V经胆总管进行原位逆行灌注,以Ficoll400不连续密度梯度离心法分离SD大鼠原代胰岛细胞,分别以AO/PI(丫啶橙/碘化丙啶)
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目的建立永生化SD大鼠胰岛细胞系。方法采用预冷的胶原酶V经胆总管进行原位逆行灌注,以Ficoll400不连续密度梯度离心法分离SD大鼠原代胰岛细胞,分别以AO/PI(丫啶橙/碘化丙啶)荧光染色法和双硫腙染色检测胰岛活性和纯度,体外葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测胰岛功能。连续转染永生化基因SV40T三天(含有该基因的包装细胞由日本冈山大学医学院naoya kobayashi教授惠赠),使用潮霉素连续筛选一周。筛选后的胰岛细胞进行挑选并单克隆培养,随后分别用RT-PCR及western-blot对筛选后的胰岛细胞进行mRNA水平和蛋白水平分析并再次体外实验检测胰岛细胞功能。结果本实验采用SV40T基因转染SD大鼠胰岛细胞,经过潮霉素筛选后,所获得的胰岛保持原代胰岛细胞形态并可进行传代培养(目前已传30代)。RT-PCR检测到SV40T mRNA及胰岛细胞特异性转录因子PDX-1,Nkx6.1及insulin的表达。western-blot检测到SV40T蛋白的表达。体外葡萄糖刺激胰岛素释放实验显示该胰岛细胞株功能良好。结论成功的构建了永生化SD大鼠胰岛细胞系。
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