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鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,Cy HV-3),又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV),是引起鲤鱼、锦鲤及其变种高度传染性锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease,KHVD)的病原。KHVD自1997年首次报道以来,在全球多个国家传播、流行,范围覆盖亚洲、欧洲、北美及非洲多个国家地区,给鲤鱼及锦鲤养殖业造成无可估量的经济损失。Cy HV-3隶属于疱疹病毒目,异疱疹病毒科,鲤疱疹病毒属,是具有囊膜包裹的双链DNA病毒。病毒的囊膜蛋白在识别宿主细胞受体介导病毒入侵等方面具有关键性的作用,而关于Cy HV-3囊膜蛋白的研究却非常有限。本论文将对Cy HV-3纯化病毒粒子和囊膜组分进行蛋白质组分析,筛选病毒可能存在的囊膜蛋白,在此基础上对推测的囊膜蛋白ORF136和ORF25进行定位研究,试验证实ORF136和ORF25为Cy HV-3的囊膜蛋白,为后续的蛋白功能研究奠定基础。全文内容分为以下三个部分:1、Cy HV-3增殖与纯化:分别将Cy HV-3 GZ1301分离株和E分离株感染敏感细胞系鲤鱼脑细胞(Common carp brain,CCB),进行病毒大量增殖,待细胞出现明显的细胞病变效应(Cytopathic Effect,CPE)后收集病毒悬液。采用20%~66%蔗糖密度梯度超速离心方法对病毒悬液进行纯化。透射电镜观察发现,66%密度蔗糖收集到大量病毒粒子,几乎不含细胞杂质,完整的病毒颗粒直径为150~200 nm,与之前的报道一致。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与考马斯亮蓝染色法显示纯化的病毒可看到清晰的蛋白条带。利用1%的非离子去垢剂Triton X-100对病毒颗粒进行处理,收集囊膜成分和核衣壳成分,透射电镜观察、SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析均表明,该方法可有效用于病毒囊膜和核衣壳的分离。2、Cy HV-3蛋白质组分析:将纯化的Cy HV-3病毒颗粒和分离的病毒囊膜组分进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色脱色后,割胶胰酶消化,进行液相色谱串联质谱分析(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS),用MASCOT检索uniprot数据库。分析显示两株不同分离株纯化的病毒颗粒一共鉴定到46个蛋白,包括14个囊膜蛋白、4个衣壳蛋白、2个皮层蛋白和26个未知蛋白,除了与之前报道的共有蛋白之外,还新鉴定了4个蛋白,分别是ORF82、ORF88、ORF121和ORF139;囊膜组分一共鉴定到16个蛋白。综合结果表明Cy HV-3至少存在46个结构蛋白,包括22个囊膜蛋白、4个衣壳蛋白、2个皮层蛋白和18个未知蛋白。基于鲤鱼全基因组数据的蛋白鉴定一共检测到22个Cy HV-3相关的宿主蛋白,涉及压力应激、信号转导和代谢等功能。3、ORF136和ORF25蛋白鉴定:在上一部分囊膜蛋白筛选的基础上,我们对囊膜蛋白ORF136和ORF25进行了进一步鉴定。首先对ORF136基因编码蛋白氨基酸序列预测抗原性片段进行PCR扩增,并与原核载体p ET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,运用免疫印迹和免疫荧光技术对抗体进行鉴定。另外,对ORF136进行PCR扩增,与真核表达载体p VAX1连接,构建重组真核表达载体p VAX1-ORF136。利用制备的ORF136多克隆抗体对ORF136蛋白进行免疫印迹、免疫荧光和免疫电镜定位。免疫印迹分析结果表明,纯化的病毒颗粒和分离的囊膜均能检测到特异的蛋白条带,大小与预测一致,约为15 KDa,表明ORF136蛋白为囊膜蛋白;激光共聚焦扫描显微镜观察显示,感染Cy HV-3的CCB细胞和转染p VAX1-ORF136的CCB细胞,均在细胞质中检测到绿色荧光信号,表明该蛋白主要定位在细胞质。免疫电镜技术进一步证明了ORF136定位在Cy HV-3的囊膜上。同样,利用特异性的ORF25多克隆抗体对ORF25蛋白进行免疫印迹和间接免疫荧光分析。免疫印迹分析结果表明纯化的病毒颗粒和分离的囊膜在100~130 KDa处均能检测到特异的蛋白条带,虽然大小与预测的65 KDa不一致,但可以表明该蛋白定位在囊膜上。激光共聚焦扫描显微镜观察显示,在感染Cy HV-3的CCB细胞和转染重组真核表达载体pc DNA33-ORF25的CCB细胞质中检测到绿色荧光信号,表明该蛋白主要定位在细胞质。本文对纯化的Cy HV-3病毒颗粒和囊膜组分进行了蛋白质组分析,并运用免疫印迹、免疫荧光和/或免疫电镜等技术对囊膜蛋白ORF136和ORF25进行了鉴定,将为后续的功能研究奠定基础。