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激活的胰腺星状细胞(PSC)在胰腺纤维化发生过程中发挥关键作用。在正常胰腺中PSC呈静止状态胞浆中含有维生素A颗粒。当暴露于刺激信号PSC由静止转化为激活状态胞浆中维生素A消失,表达细胞骨架蛋白:α-平滑肌动蛋白(α-SMA),波形蛋白,结蛋白及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)。激活的PSC可产生致纤维化细胞因子转化生长因子β1(TGF-β1)和促分裂细胞因子血小板衍生生长因子(PDGF),合成和分泌包括I型胶原(Col1)在内的细胞外基质(ECM),基质金属蛋白酶(MMPs,如MMP-1,MMP-2等)及其抑制物(TIMPs)。TGF-β1经旁分泌和自分泌调节PSC自身激活过程,增加α-SMA和Col1表达,下调MMP-9合成。白细胞介素6(IL-6)是一种重要的致炎症因子,可促进PSC激活。全反式维甲酸(ATRA)是具有活性的维生素A代谢物,可诱导啮齿类动物PSC向静止型转化,减少ECM合成,抑制乙醇诱导的α-SMA表达。PSC在胰腺纤维化形成和ECM逆转均发挥关键作用,原代人PSC由于胰腺组织块来源缺乏和细胞老化难以长期培养,有限的细胞数量不能满足其机能研究。曾有人建立人胰腺PSC系,由于生长速度的缺陷不能确切展示原代PSC的表型特征,难以被广泛使用。本研究采用RSV启动子/增强子驱动SV40大抗原在人原代激活PSC表达建立了永生化人PSC系(HP-1细胞)。进而通过对HP-1细胞和PSC生物学性状和蛋白组学分析,评价HP-1细胞在细胞培养水平研究PSC介导人类胰腺纤维化的可能性。在此基础上,通过建立ALC诱导HP-1细胞体外模型,明确ATRA抑制ALC作用下HP-1细胞介导纤维化的作用特征,并尝试从ATRA抑制TGF-β1信号通路阐明其抗纤维化机制。本论文分为两个部分:第一部分:人胰腺星状细胞系的建立及其生物学性状和蛋白组学分析研究目的:本研究旨在采用RSV启动子/加强子驱动SV40 T抗原表达建立永生化人PSC系(HP-1细胞)。通过测定HP-1细胞和原代激活PSC基质蛋白和基质重构调节蛋白对刺激因子反应性和蛋白质表达谱,评价HP-1细胞在研究PSC介导胰腺纤维化发生学作为可利用工具的可能性。研究方法:采用胶原酶P灌注消化法分离人胰腺良性占位病变周边正常胰腺组织的PSC,10%FBS DMEM培养,4次传代的激活PSC用于本研究。采用RSV启动子/增强子驱动SV40 T抗原在人原代激活PSC表达建立永生化人PSC系HP-1细胞。采用免疫细胞化学检测HP-1细胞SV 40 T抗原和GFAP表达,免疫荧光法测定波形蛋白,结蛋白和α-SMA表达;采用实时定量PCR(RT-q PCR)测定HP-1细胞和PSC的α-SMA、CTGF、Col1A1、MMP-1、MMP-2和TIMP-2 m RNA水平;采用Western Blot测定上述基质蛋白和基质重构调节蛋白与细胞受体TGFβR2、Bambi、PDGFRβ和PPRPγ蛋白含量。采用脂质体Fu GENE 6和X-Treme GENE Si RNA分别对HP-1细胞转染绿色荧光蛋白表达质粒p EGFP-N1。分离HP-1细胞和PSC的裂解蛋白质,胰酶消化,串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)标记,用EASY-n LC 1000超高效液相系统进行分离,提交高效质谱Q Exactive TM Plus组合型四极杆Orbitrap TM质谱仪(MS/MS)进行检测和分析。本研究以1.5倍数变化为差异表达阈值,t-检验p<0.05为显著性差异,进而确定两种细胞间的显著差异蛋白质。研究结果:本研究建立了永生化HP-1细胞,该细胞核中表达SV40 T抗原,胞浆中表达GFAP、波形蛋白、结蛋白和α-SMA特征性细胞骨架蛋白与TGFβR2、Bambi、PDGFRβ和PPRPγ受体。进一步研究发现HP-1细胞和PSC在TGF-β1诱导的α-SMA、CTGF、Col1A1和TIMP-2 m RNA与蛋白合成增加以及MMP-1/2 m RNA和蛋白合成减少方面表现一致。HP-1细胞脂质体Fu GNE 6和X-Treme GENE Si RNA转染效率分别达61.8%和88.65%。HP-1细胞和PSC比较蛋白组学研究显示:两种细胞可定量的共享蛋白质是4537种,未发现单一细胞仅有的蛋白质。统计学分析显示54种蛋白质在HP-1细胞中上调,45种蛋白质在PSC中上调,其余4438种蛋白质的表达(占两种细胞可定量总蛋白质的97.8%)在这两种细胞之间没有显著差异。差异蛋白若以>±2.0倍数变化的绝对值为界不含有细胞外基质蛋白,纤维源性细胞因子,细胞生长因子及基质重构调节蛋白。结论:HP-1细胞具有激活PSC的特征性标志,对纤维源性细胞因子刺激反应性和蛋白质表达谱与PSC基本一致,其可成为有效的工具用于PSC介导胰腺纤维化发生学的研究。第二部分:维甲酸抑制PSC介导胰腺纤维化作用的实验研究研究目的:本研究旨在明确ATRA抑制酒精(ALC)作用下人PSC介导胰腺纤维化的作用特征,评价ATRA抑制TGF-β1信号通路在抗胰腺纤维化的作用。研究方法:我们采用RSV启动子/增强子驱动SV40 T抗原在人原代激活PSC表达建立了永生化人PSC系HP-1细胞。本研究采用HP-1细胞建立了低血清培养模型。采用Bodipy荧光染色法检测HP-1细胞内脂质颗粒,Western blot检测HP-1细胞Smad2、p Smad2、Smad3和p Smad3的表达。采用RT-q PCR检测HP-1细胞Col1A1、α-SMA、IL-6、TGF-β1和MMP-9m RNA转录水平,酶联免疫吸附实验(ELISA)测定Col1A1、α-SMA、IL-6、TGF-β1和MMP-9蛋白含量。研究结果:本研究发现ATRA(5μM)可明显促进低血清培养(0.5%FBS DMEM)和ALC(50 m M)诱导的HP-1细胞中脂质颗粒形成,诱导细胞向静止转化。ALC处理的HP-1细胞IL-6和TGF-β1 m RNA合成和蛋白质分泌水平均较对照组明显升高(4组间p均<0.001)。采用ALC和IL-6(100 ng/ml)分别处理HP-1细胞,TGF-β1合成水平均提高,24 h达到最高值,而ALC处理的HP-1细胞合成Col1A1和α-SMA 48 h后水平较高。进一步采用ATRA与ALC同时处理HP-1细胞结果发现:ATRA不仅使ALC诱导24 h出现的TGF-β1峰值明显下降,也可使48 h出现的Col1A1和α-SMA升高水平明显下降。为明确ATRA是否可抑制TGF-β1诱导Smad2/3磷酸化,采用外源性TGF-β1(5 ng/ml)预处理HP-1细胞45 min后加入ATRA,结果发现ATRA可明显抑制TGF-β1诱导的Smad2/3磷酸化(两者P<0.001),明显抑制TGF-β1诱导的Col1A1和α-SMA m RNA和蛋白质合成(4组间P<0.001),明显增加MMP-9 m RNA和蛋白质合成(两者P<0.001)。结论:ATRA可促进人PSC向静止转化,通过下调TGF-β1/Smad2/3信号通路,抑制PSC介导的胶原合成和促进其降解。本研究进一步为ATRA防治胰腺纤维化提供了实验依据和理论基础。