【摘 要】
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植物的生长发育和形态建成与光信号的转导和微管的延伸与动态相关。SPR1是一类植物特有的微管结合蛋白(microtubule associated protein,MAP)。已有的研究表明,SPR1参与调控细胞的生长和对非生物胁迫的响应。目前对SPR1的研究多以拟南芥AtSPR1为对象,而针对木本植物SPR1的功能及其对微管调控特征的研究尚未涉及,特别是SPR1是否参与光介导的微管延伸和细胞扩张仍缺
【基金项目】
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“国家自然科学基金,青年科学基金项目(31400569)柳树SPR基因家族调控微管延伸方向分子机理研究2015.01-2017.12”; “中央级公益性科研院所专项资金项目,杨树SPR1互作蛋白的筛选及功能研究(CAFYBB2018QB001)2018.01-2020.12;
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植物的生长发育和形态建成与光信号的转导和微管的延伸与动态相关。SPR1是一类植物特有的微管结合蛋白(microtubule associated protein,MAP)。已有的研究表明,SPR1参与调控细胞的生长和对非生物胁迫的响应。目前对SPR1的研究多以拟南芥AtSPR1为对象,而针对木本植物SPR1的功能及其对微管调控特征的研究尚未涉及,特别是SPR1是否参与光介导的微管延伸和细胞扩张仍缺乏了解。基于此,本论文以我国乡土树种旱柳(Salix matsudana Koidz)SmSPR1为对象,重点研究了SmSPR1参与光相关的微管延伸和细胞扩张的分子机制,取得了如下结果:(1)启动子分析发现,SmSPR1主要在快速生长的细胞中表达。SmSPR1-GFP蛋白定位分析表明,SmSPR1主要分布于细胞膜、细胞质和细胞核。免疫荧光和共沉淀实验结果表明,SmSPR1可以直接结合微管。微管解聚药理学分析表明,SmSPR1具有稳定微管的特性,过量表达SmSPR1导致植株对微管解聚药物PPM(propyzamide)的耐受性增强。(2)SPR1在植物中的功能具有保守性。将SmSPR1基因分别转入银腺杨和拟南芥中,结果显示与对照植株相比,SmSPR1转基因银腺杨和拟南芥植株均对PPM的耐受性增强。在拟南芥本底过表达AtSPR1,转基因幼苗的表型与过表达SmSPR1幼苗的表型相似。突变体回复实验结果显示,SmSPR1能够回复拟南芥spr1突变体的表型,从而证明SPR1在植物中的功能具有一致性。(3)SmSPR1对植物形态的影响与光相关。SmSPR1在体内功能的研究表明,SmSPR1在光照和黑暗条件下的生理功能存在差异。对比分析野生型和过表达SmSPR1转基因植株,结果显示在光下SmSPR1转基因植株表型与野生型没有明显差异,而在暗中SmSPR1过量表达导致黄化苗下胚轴发生右旋生长。将暗培养的转基因幼苗转入光下,下胚轴恢复竖直生长。光培养的转基因幼苗转入暗中,伸长的下胚轴重现螺旋形态。进一步试验发现,在光下SmSPR1转基因下胚轴细胞形态及微管组织排列与野生型无差异,而暗中转基因黄化下胚轴细胞以右手螺旋方式伸长且增大,其微管列阵呈左手螺旋方式,表明在光暗转换过程中,SmSPR1参与了微管组织的重新排列。通过转录组对比分析野生型和过表达SmSPR1转基因植株中基因的表达,发现在黑暗条件下SmSPR1转基因黄化苗中234个基因的表达量发生了变化,其中多个基因参与植物的光诱导、叶绿素合成和光系统组成,表明这些基因可能直接或间接的参与了光介导的植物形态建成过程。通过酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)、双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)等实验分离并鉴定出2个与SmSPR1相互作用的光相关蛋白,CSN5A(the subunit 5a of CSN)和HY5(ELONGATED HYPOCOTYL 5),推测SPR1在光照和黑暗条件下与不同蛋白相互作用来调节微管组织的排列。由于HY5在暗下与COP1结合,其功能被抑制,因此,在光下SPR1与CSN、HY5、EB1结合,而在暗中SPR1只能与CSN和EB1结合以调节微管组织的排列和动态。本论文初步证明和揭示了旱柳微管结合蛋白SmSPR1通过调控微管组织的排列参与光介导的细胞扩张,这为进一步揭示SPR1参与植物形态建成的分子机制奠定了基础。
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