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NS1(non-structuralprotein1)是一种与流感病毒毒力密切相关的多功能蛋白质，它通过与宿主细胞多种组分相互作用，发挥复杂的生物学效应。不同毒株NS1蛋白的氨基酸序列存在差异，这造成不同毒株NS1蛋白引起的细胞凋亡效应以及其在细胞中的定位也不尽相同，从而对流感病毒的致病力产生一定的影响，但确切的分子机制并不清楚。本研究以人季节性流感病毒H3N2亚型和新型禽流感病毒H7N9亚型的NS1蛋白为研究对象，分别解析了H3N2/NS1蛋白和H7N9/NS1蛋白诱导细胞凋亡的分子机制，同时揭示不同毒株NS1蛋白在细胞中的定位情况。 在本研究中，我们首先克隆不同毒株NS1蛋白的表达载体并转染HEK293T细胞，对表达NS1蛋白的细胞中caspase3/7的活性和PARP(poly ADP-ribose polymerase)的剪切进行检测，结果显示，H3N2/NS1能够诱导激活caspase3/7，并剪切PARP。生物信息学分析H3N2/NS1蛋白C末端含有一个核仁定位信号（nucleolar localization signal，NoLS）。免疫荧光与免疫沉淀结果表明 H3N2/NS1能靶向细胞核仁并与核仁素（nucleolin，NCL）相互作用。荧光定量PCR（Real-time PCR）和Western blot检测H3N2/NS1蛋白表达的细胞中pre-45S rRNA的合成以及p53蛋白的表达水平，结果显示与mock相比，H3N2/NS1蛋白表达的细胞中rRNA的合成减少至20~30％，p53蛋白显著积累。进一步的染色质免疫沉淀结果显示H3N2/NS1表达的细胞中，NCL与rRNA启动子区上游控制元件（upstream control element，UCE）的结合显著减少，同时RNA聚合酶I大亚单位RPA194与UCE的相互作用也明显受到影响。对基因组DNA亚硫酸盐处理后的甲基化特异PCR结果显示，与mock细胞相比，H3N2/NS1表达的细胞UCE高甲基化（95.5% vs25.7%）。对NCL进行siRNA干扰，结果显示在NCL合成受到抑制的情况下，pre-45S rRNA的合成显著下降、p53蛋白明显积累、UCE甲基化程度显著上调，并且对NCL的干扰效果越好，细胞中pre-45S rRNA下降、p53蛋白增加以及UCE甲基化程度越明显。免疫共沉淀的结果显示，核糖体蛋白RPL5、RPL11、RPL23以及RLPS7均能够与MDM2相互作用。通过这一系列的实验结果，我们提出H3N2/NS1蛋白诱导HEK293T细胞凋亡的新机制：NS1蛋白C末端的NoLS使NS1蛋白靶向细胞核仁并与NCL结合，二者的结合使得rRNA启动子UCE高甲基化，进而使UCE与NCL的结合受阻，同时影响RNA聚合酶I与UCE的结合，进而使RNA聚合酶I介导的rRNA转录受到抑制，引发细胞的核仁应激，rRNA与核糖体蛋白（Ribosomal proteins，RPs）装配受到干扰，游离的RPs从核仁中释放出去并绑定MDM2，从而抑制p53的泛素化降解，引起细胞中p53的积累，从而激活caspase3/7，剪切PARP引起细胞凋亡。 另外，我们转染H7N9/NS1表达质粒进A549细胞，通过检测caspase3/7活性以及PARP的剪切，明确H7N9/NS1能够诱导A549细胞凋亡，qPCR以及Western blot检测Bad和BAK的表达以及Cleaved-Caspase-7，结果显示H7N9/NS1表达的细胞中BAK1和Bad的水平显著增加，caspase-7表达上调。qPCR和Western blot检测H7N9/NS1转染不同时间p53的mRNA和蛋白的表达变化，结果显示H7N9/NS1转染18和24 h后，细胞中p53的表达量分别提高1.5～1.8倍，而mRNA的水平并无显著变化。我们对p53的ser15、ser20、ser37以及ser46位的磷酸化水平进行检测，结果表明p53在ser37和ser46的磷酸化水平升高，分别为2.89倍和3.05倍，而在ser15和ser20没有发生明显的磷酸化。这些结果显示，H7N9/NS1的表达能够使p53发生ser37和ser46位点的磷酸化，进而增加p53的稳定性，激活caspase3和caspase7并剪切PARP，从而诱导细胞凋亡。 此外，我们构建了H1N1/NS1，H3N2/NS1，H5N1/NS1，H7N9/NS1的GFP融合表达质粒，通过瞬时转染和细胞质核分离实验，研究不同毒株NS1蛋白在8株不同细胞中的亚细胞定位。结果显示，4种不同毒株NS1在所有8株细胞核中的分布都占主导地位，除此之外的分布又各有特点：H1N1/NS1与H7N9/NS1都呈现典型的细胞质分布；H3N2/NS1和H5N1/NS1在细胞质中的定位不明显；H3N2/NS1在核质均匀分布并在核仁处聚积，而H5N1/NS1仅分布在细胞核质中。同时各NS1蛋白在Vero细胞质中分布均不明显，而在COS-7细胞中所有4种NS1蛋白均呈现一致的细胞质与细胞核分布，在细胞核仁中均不可见，包括H3N2/NS1蛋白。NS1蛋白亚细胞定位具有毒株和细胞特异性。 综上，本研究分别解析了H3N2/NS1与H7N9/NS1蛋白诱导细胞凋亡的分子机制，这些机制可能是不同流感病毒逃逸宿主免疫的策略之一，我们的研究有助于详细了解NS1在流感病毒致病过程的作用，从而为预防和控制流感病毒提供参考。