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石化燃料日趋枯竭和环境压力的日益增强,迫使人类急切的寻找一种新型的、可再生的洁净能源。单细胞微藻的光合效率是油棕、水稻等作物的数十倍,而且生长快,含油量高,不与农作物争地,是具有很大应用前景的新能源植物。由于良种培育及高密度、低成本养殖等关键技术至今尚未解决,能源微藻(即油藻)产业化成本一直居高不下。故而,筛选高产、稳产、高含油量等优良农艺性状的新藻种、探索低成本培养条件是能源微藻能否产业化的关键,同时也是国内外研究的一大热点。本研究旨在通过试验,筛选高生物量、高含油量藻株,探索优势藻株生长及油脂积累条件,同时利用育种的方法培育新型油藻,为藻类的开发利用、生物质能源的深入研究奠定基础。
本试验以尼罗红为染料,优化了尼罗红荧光染色检测微藻中油脂相对含量的条件,确定尼罗红染色质量浓度为1.0μg/ml,染色时间为6min,二甲基亚砜体积浓度为20%,待测藻液密度OD600=0.12~0.52时染色效果最佳,为大规模筛选高含油量微藻奠定了基础。
以含油量高、生产率高为选育目标,用尼罗红染色荧光显微镜检测法对本实验室496株微藻进行了初步筛选,获得了40株油脂含量相对较高的藻株,通过生长和油脂动态积累情况进行跟踪检测,比较同一藻液吸光值(OD=0.35)时脂荧光强度、最高脂荧光强度和比平均生长速率等指标,初步确定编号La4-37、La2-14、SA2-1、SA2-17、SA2-8的藻株具有含油量高、生产率高等优良性状,具有作为生物柴油原料的潜力。重点对编号为La4-37的藻株进行了研究。通过细胞形态观察发现,La4-37细胞成球形,色素体为单个,绿色,杯状,细胞大小为3~10μm,以孢子生殖为主;扩增18S rDNA,测序获得大小1756bp的DNA序列,通过生物信息学分析,确定La4-37为绿藻门(Chlorophyta),原球藻纲(Trebouxiophycea),小球藻科(Chlorellaceae),小球藻属(Chlorella),Chlorella sorokiniana种。为更清楚了解La4-37生长及油脂积累情况,对藻株生长和油脂情况进行动态跟踪,发现藻株油脂在迟滞期有一个短暂积累,在指数生长后期和平稳期大量积累,最后通过检测La4-37平稳期生物量(1.072g/l),比平均生长速率(0.26d-1),脂荧光强度(8.71×10-5/cell),并与其它产油微藻比较发现,筛选得到的藻株La4-37具有含油量高,生物量高、生长速率快的优良性状,具有作为能源微藻开发的潜力。
环境条件会严重影响微藻的生长和油脂产量,而氮浓度和初始pH值是影响微藻生长和油脂积累较关键的环境因子。不同氮浓度藻株生长和油脂积累情况跟踪试验发现:随着氮浓度的降低,藻细胞油脂积累能力增强,生长速度降低。La4-37的pH梯度试验表明:在初始pH值为7~8时生长最好,初始pH值较低的培养基中(pH值为4和5),藻株几乎不能生长,在初始pH值高达12的培养基中也有一定程度的生长(比平均生长速率为0.2 d-1);油脂积累随着pH的升高而增强,初始pH值为12时最高。
为进一步获得含油量和生长速率更高的藻株,采用紫外线辐射法对La4-37进行诱变处理,经过初步筛选,获得296株诱变藻株,通过尼罗红荧光检测法对获得的藻株脂进行荧光检测,并与同密度下原始藻株脂荧光强度比较,筛选获得相对含油量最大的诱变藻株M077和M040。通过对诱变株生长及脂荧光强度动态跟踪发现,诱变株生长周期和油脂积累时期基本一样,当达到平稳期时,诱变株油脂积累能力均有较大提高(脂荧光强度分别是原始藻株的6.2倍和1.7倍),但生物量略有下降,M077为原始藻株的49%,M040为原始藻株的93%。